生物反应器培养工艺的狂犬病毒疫苗研究进展

2020-03-03刘文凯王家敏乔自林

甘肃畜牧兽医 2020年10期

刘文凯，王家敏，乔自林＊

（1.西北民族大学生物医学研究中心甘肃省动物细胞技术创新中心，甘肃兰州 730030；2.西北民族大学生物医学研究中心生物工程与技术国家民委重点实验室，甘肃兰州 730030；3.西北民族大学生命科学工程学院，甘肃兰州 730030）

狂犬病（Rabies）俗称“疯狗病”，是由狂犬病毒引起的人畜共患的传染病，其发病期会持续数月或数年，病毒感染周边神经直至脊髓，并迅速扩散至大脑，引发致命性的脑炎，最终导致宿主死亡[1]。全球每年因感染狂犬病毒导致死亡的超过50 000人，且大部分发生在亚洲。目前临床上还没有治疗狂犬病的有效措施，通常患者发病后会在3～6 d内因呼吸或循环衰竭而死亡。

狂犬病毒早在1884年病毒发现之前，法国科学家巴斯德就发明了狂犬疫苗。巴斯德第一次采用疫苗来治疗被咬伤的人类患者，是利用被狂犬病毒侵染的兔子的脊髓浆液。后来逐渐发展成为使用动物脑组织疫苗，此种疫苗预防效果井不太理想，且疫苗内含有大量的非特异性脑组织成分，可能发生较大的局部与全身性不良反应。细胞培养工艺狂犬病疫苗的问世，解决了组织疫苗的缺陷。生物反应器培养技术与传统转瓶贴壁培养工艺相比，可使单位体积内有效细胞数量增加，且生产流程及过程自动化程度高，不仅减少了污染细胞的机会，同时减少人为操作因素影响，已成为疫苗生产的主流工艺。本文对我国生物反应器生产狂犬病毒疫苗的工艺进展进行了总结。

1 全悬浮培养工艺

全悬浮培养指的是在受到不断搅动或摇动的液体培养基里，培养单细胞及小细胞团的培养系统，是非贴壁依赖性细胞的一种培养方式。某些贴壁依赖性细胞经过适应和驯化也可用此方法培养。在20世纪70年代就有利用悬浮生长的 BHK 细胞感染 Flury LEP 株病毒生产灭活的兽用狂犬疫苗的报道[2]。20世纪90年代后, 法国巴斯德研究所将生物反应器应用于BHK细胞悬浮培养，制备了实验狂犬病疫苗[3]。而国内悬浮培养工业化生产虽起步较晚，但已迎头赶上。金宇保灵利用BHK21-C13细胞悬浮培养制造兽用狂犬灭活冻干疫苗，在生物反应器中按照0.2～0.5×106cell/ml接种BHK21-C13细胞，在转速60～110rpm、DO20%～60%时接入狂犬病毒生产种毒进行培养，获得高滴度的病毒原液，克服了转瓶培养中工艺繁琐、抗原含量低和效力低等技术难题[4]。青岛蔚蓝在此基础上利用对BHK21细胞进行无血清悬浮培养，先用5%血清培养基适应，再逐渐降低血清含量后连续驯化，待细胞完全适应无血清悬浮培养基后，在转速80r/min、培养温度37℃和溶氧30%～45%的条件下采用半连续流加方式培养，细胞活力高于95%，密度达到5×106cell/ml，狂犬病毒滴度大于或等于108LogLD50/ml[5]。北京生科利用连续灌流培养，在细胞密度达到2～4×106cell/ml时，用狂犬病毒株PV/BHK-21进行病毒感染，可以多次收获病毒，滴度达107.5LogLD50/ml。收获的病毒原液进行过滤系统处理和灭活，可制成免疫性高、安全性好的狂犬病灭活疫苗，且利用无血清培养，可避免血清源性污染，简化提纯程序，降低血清引起的机体过敏性反应[6]。苏州世诺采用SEQ ID NO:1的核酸分子编码的狂犬病毒G蛋白，通过生物反应器无血清悬浮培养制备疫苗，疫苗的抗原性、免疫原性与天然蛋白质相似，表达水平较高，对动物没有致病性，大大降低了生产成本[7]。

2 微载体培养工艺

微载体以微小颗粒作为细胞贴附的载体，可提供相当大的贴附面积。由于体积很小，比重较轻，在轻度搅拌下即可使得细胞悬浮在培养液内，最终能够使细胞在载体表面繁殖成单层的一种细胞培养技术。黄仕和等利用25代CTN—IV的狂犬毒株在126代Vero细胞种子上传代，并从方瓶—转瓶,再逐步培养至50L生物反应器，传代毒力基本上稳定在7.0 LogLD50/ml以上[8]。李平忠等人以146代的Vero细胞接种于7L反应器中进行培养，在参数为温度37℃、pH7.2、溶氧50%空气饱和度、搅拌速度50r/min时，微载体加量分别为：3g/L、4g/L和6g/L，采用灌流法培养，接种狂犬病毒aG株病毒，最终病毒滴度达106LogLD50/ml，最高效价为6.49IU/ml[9]。采用激流式生物反应器（AP20C）纸片载体培养BHK－21细胞，生物反应器细胞培养的参数为温度36.5℃、pH7.0、DO50%、振荡器速度60rpm/min时，在培养72～144h后接入Flury株，lgLD50平均为5.75/0.03ml。张家友比较了微载体与片状载体培养MDCK-G1细胞的效果，在搅拌转速55r／min，初始细胞接种密度3×105cell／ml，载体量8g／L的条件下，微载体培养最高细胞密度为（5.03±0.12）×106cell／ml；而片状载体在搅拌转速120r／min，初始细胞接种密度2×105cell／ml，载体量200g的条件下，最高细胞密度为（10.22±0.69）×106cell／ml[10]。相比转瓶传统方法，微载体系统可以提供极高的表面积与体积比，增加病毒产量，并且显著减少所需传统培养容器的数量，节约空间和成本。

3 片状载体培养工艺

片状载体培养是在反应器中填充一定材质的填充物，供细胞贴壁生长。袁延宝等用15L生物反应器采用片状载体对Vero细胞培养，采用批次培养和连续灌流培养进行试验，密度均达到6×106cell/ml以上，病毒收获液的毒力滴度可以达到7.0～8.0 LogLD50/ml之间[11]，王辉等利用篮式反应器细胞消化的方法，在温度36.5±1℃、pH7.2～7.4、DO 40%～70%、搅拌速度50～90r/min时，收获细胞悬液，此方法可实现篮式反应器Vero细胞培养工艺的逐级放大[12]除Vero细胞以外，武汉赛科采用片状载体袋在温度37℃、PH7.2、溶解氧50%、摆床角度6～9°，速度10～30rmp/min直接进行原代CEF细胞培养，然后接入狂犬病毒培养解决了宿主细胞DNA残留问题。台湾赛宇在具有固定床篮式搅拌系统的Celligen310型14L生物反应器中培养Vero细胞，按照接种密度0.5～2×106cells/ml，温度30～35℃、溶氧20%～90%、葡萄糖浓度25～40um、搅拌速率20～100rpm/min培养，细胞密度达5×108cell/ml，病毒滴度呈大幅度对数增加，最高可达1×109FFU/ml，可大批量生产狂犬疫苗[13]。另外，片状载体袋通过前后或左右摆动来进行传氧，在培养过程中使摆床静态和动态相结合，传质传氧效率高[14]。上海楚鲲制造的新型片状载体中的页片向外张开，并采用载体床层和搅拌桨的新颖结合方式在简单更换搅拌桨的情况下可多种培养[15]，广州诺诚采用的生物反应器片状载体清洗装置，通过把片状载体装入合适的尼龙网袋中后放入载体清洗仪中，设定清洗时间、清洗次数和进水量可以实现载体的清洗工作，可实现片状载体的回收利用，极大的降低生产成本[16]，与采用微载体的罐培养工艺相比，片状载体可以将细胞固定在一个相对平稳的环境中，因此不会受到搅拌系统剪切力的影响而造成细胞脱落，细胞培养液的交换更加充分，有利于pH和DO的调控，并在收获病毒液过程中使得脱落细胞减少，有利于疫苗的纯化[13]。