线粒体铁蛋白和年龄相关性黄斑变性的研究进展

许致玉，董 晶，张 璐

0引言

年龄相关性黄斑变性 (age-related macular degeneration, ARMD)又称老年性黄斑变性，是一种与年龄相关的致盲性退行性眼底病变。欧盟2015年大约有6700万人受到任何ARMD的影响，并且由于人口老龄化，这一数字预计到2050年将增加15%[1]。随着我国人口老龄化社会的到来,发病人数将逐年增加。由于ARMD的发病机制复杂，目前对于ARMD的治疗发展并不完善，因此ARMD的治疗效果并不能让广大患者感到满意。线粒体铁蛋白(mitochondrial ferritin，FTMT)是一个组织表达受限蛋白,仅表达于心脏、睾丸、脑和呼吸活动活跃的组织。进一步研究发现,FTMT同样具有铁离子平衡和抗氧化功能。目前，已有越来越多的学者开始关注FTMT在ARMD中的发生、发展及作用机制。

1 FTMT

FTMT是一种新近发现的位于线粒体内的铁储存蛋白。在体内铁代谢及调节中，FTMT起着重要作用。它是一种前体，以线粒体为目标，然后加工成一种功能蛋白，其结构类似于细胞质中的铁蛋白。与胞质性铁蛋白一样，FTMT在体内和体外都含有铁，这与其保守的铁氧化酶中心一致。与其不同的是，FTMT的成熟功能形式只分布于线粒体内，并且FTMT的分布局限于特定的组织或者器官中；主要分布于睾丸、脊髓神经炎、视网膜、心脏和胸腺等，不存在于肝脏或者脾脏等主要的铁储存器官中。FTMT可以将细胞外和胞浆内的铁离子以三价铁的形式储存在线粒体中，由此可以减少由二价铁离子引起的氧化应激产物，但是FTMT的mRNA序列中，不含铁调控元件序列，这意味着其表达不受铁的调控。由于对铁的获取作用，体内的氧化应激水平进一步被FTMT所抑制，在退行性神经疾病中起到保护作用[2]。在一些免疫组化中显示，FTMT表达于视网膜，并且表达量会随着铁的水平变化而改变(呈正相关)[3]。

FTMT是一种铁螯合蛋白，在具有高代谢活性和氧消耗的细胞类型(包括人类视网膜)中表达，提示其在保护线粒体免受铁依赖性氧化损伤中起作用。此外，在一些ARMD患者中发现了FTMT基因的突变，这可能导致FTMT基因的缺失[4]。然而，FTMT已显示出保护线粒体免受铁细胞介导的毒性作用，从而延迟ARMD的进程。

2 ARMD

ARMD是黄斑区的退行性病变。主要表现为视物变形、中心暗点以及对比度下降等，患者多为50岁以上,随着年龄增长发病率增加。一般表现为双眼先后发病或同时发病，并且进行性损害视力，严重影响老年人的生活质量。有学者研究表明，在全球50岁以上的中国人群中，早期和晚期ARMD的总合并患病率分别为4.9%和0.7%[5]。

ARMD根据临床表现和病理改变的不同分为两型：(1)萎缩型ARMD，或称为非渗出型ARMD,或干性ARMD；(2) 渗出型ARMD，或称为湿性ARMD。其中最常见的为干性ARMD，占ARMD患者中的80%～90%。临床上，两型病变的病程、眼底表现、治疗和预后各异。干性ARMD患者一般起病缓慢，患者视力渐进性减退，视网膜外层、色素上皮层、Bruch膜、脉络膜毛细血管等各层逐步萎缩、变性，眼底可见大小不一的玻璃膜疣，晚期可见到裸露的脉络膜大血管。湿性ARMD患者临床表现为突然单眼的视力下降，部分可见典型的新生血管或者黄斑区盘状瘢痕[6]。目前临床上公认的用于治疗湿性ARMD的方法为抗VEGF治疗，通常采用将可结合VEGF的特异性抗体通过球内注射的方式给药，临床效果显著。但是该药药物效果难以持续，并且费用昂贵，大大增加了治疗的成本，使绝大多数中低收入患者群体难以维系治疗。

由于ARMD的发病机制和进展机制复杂，因此很难找到病因，并且难以运用干预手段来治疗疾病。它可能与遗传因素、环境影响、慢性视网膜光损伤、营养不良、代谢紊乱等有关。但是氧化应激和自由基损伤已被确定为ARMD的危险因素。下面将探讨FTMT对ARMD的影响。

3 FTMT通过稳定低氧诱导因子-1α影响ARMD

低氧诱导因子(hypoxia-inducible factor，HIF)是20世纪90年代发现的一种依赖于氧的转录因子。HIF最初是在人肝癌细胞培养中发现并表征的，其影响促红细胞生成素基因的转录。后有研究表明，HIF亚型HIF-1在ARMD患者脉络膜新生血管膜中同样存在。由于人视网膜色素上皮细胞培养中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的产生受HIF调控，任何对HIF和PAS蛋白结构域抑制功能的干扰都会影响眼睛的氧化应激、炎症和脉络膜新生血管(choroidal neovascularization，CNV)的生成[7]。

CNV的发展是对ARMD患者快速永久性视力丧失的最重要威胁。各种临床研究表明，随着年龄的增长，视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelial cells，RPE)，Bruch膜和绒毛膜的变化会导致氧向神经视网膜中的视杆和视锥的扩散减少。因此，通过刺激RPE细胞中VEGF的过表达导致外部视网膜缺氧被认为是CNV形成的最重要驱动因素之一[8]。一旦扰乱了血管生成刺激剂和抑制剂之间的局部平衡，便可能发生CNV。VEGF是CNV的主要刺激因子，Zhao等[9]研究表明RPE细胞过度表达VEGF可诱导CNV的发生，而抑制RPE细胞中VEGF的表达则抑制新生血管的形成。HIF-1α的转录激活可上调RPE细胞和一般RPE细胞中VEGF的表达。因此，它是触发CNV形成的中心分子[10]。因此，HIF是治疗渗出性ARMD的一个有趣的治疗靶点。

Wang等[11]发现小鼠RPE中的FTMT和HIF-1α与年龄相关性是有联系的。他们通过Western blotting和免疫荧光法比较了幼龄和老年小鼠RPE和络膜中FTMT蛋白的水平。控制研究进行了评估的特异性FTMT抗体。结果显示，与3mo大的小鼠相比，使用RPE和脉络膜匀浆的Western印迹显示20mo大的小鼠的FTMT和HIF-1α蛋白水平显着升高。免疫组织化学显示，20mo大小鼠的神经节细胞(ganglion cells，GCS)，外神经丛层(outer plexiform layer，OPL)和内部节段(inner segment，IS)主要被FTMT染色。在20mo时，染色强度增加。特别是，RPE和外部脉络膜节段被强烈染色。所以，小鼠RPE中FTMT和HIF-1α水平随着年龄的增长而升高。

与此同时，该实验还证明FTMT稳定了HIF-1α并上调了VEGF的表达。研究者在人视网膜上皮细胞(ARPE-19细胞)中过表达FTMT 。 Western印迹结果显示，在正常缺氧条件下，FTMT过表达的ARPE-19细胞中的HIF -1α蛋白水平显着增加。在低氧条件下(1%O2)HIF-1 α蛋白水平高于未处理的细胞。FTMT过表达显著增加了VEGF的分泌，而这种增加被HIF-1 α修饰因子所消除，表明FTMT过表达时VEGF的上调是依赖于HIF-1α的[8]。因此，增高的氧化应激水平影响着FTMT在ARMD患者中的表达，并且HIF-1α调节FTMT来控制ARMD的发展。

4 FTMT基因突变影响ARMD

胞质铁主要完成了铁在细胞中的储存，是一条24亚基(重-h和轻-l链)的杂合聚蛋白。有学者发现，哺乳动物的功能性铁蛋白基因有三个，分别是：11号染色体上183个氨基酸编码的胞质重链(h链)； 19号染色体上175个氨基酸编码的胞质轻链(l链)和5号染色体上的无内含子基因编码的FTMT，并表达为前体，在转移到线粒体基质后被加工成成熟蛋白[7]。

在人类中，FTMT在睾丸、大脑和视网膜光感受器内表达， FTMT的表达影响细胞内铁稳态，使铁进入线粒体，FTMT通过氧化潜在的有毒亚铁并且消耗活性氧(reactive oxygen species，ROS)，保护HeLa细胞免受氧化损伤[12]。这些数据表明，FTMT的主要功能是通过调节线粒体不稳定铁池和ROS的产生，以防止氧化损伤[12]，并提示FTMT在线粒体中对铁依赖毒性具有保护作用。FTMT功能在以细胞铁超载和线粒体衰退引起的铁代谢紊乱为特征的病理中可能特别重要[13]。最近，在一些ARMD患者体内发现FTMT的基因突变，而该突变可造成FTMT功能的缺失[14]。

Stefania等[4]对一组ARMD患者的FTMT基因进行了突变扫描，以评估其可能对ARMD表型的发病机制或调节的研究贡献。到目前为止，FTMT基因中的一些杂合取代物已经在与细胞或FTMT表达或脑铁水平改变相关的疾病患者中被发现[15]。他们从一个被发现携带一个之前从未报道的FTMT基因突变的老年白人女性的血液中进行FTMT基因的采集及提取，从EDTA抗凝血中提取DNA中通过变性高效液相色谱和自动测序进行分析，短扩增产生的缺失片段经电泳分离后洗脱，通过神经网络程序对剪接位点进行预测，通过铁蛋白重组、变性复性实验以获得共组装的24序列碱基，通过免疫学方法将FTMT抗体孵育，进行基因结果的分析。结果显示，50例意大利ARMD患者的FTMT基因扫描显示，只有1例ARMD患者的FTMT2基因洗脱谱发生了改变。该突变包括一个14bp的缺失和一个2bp的插入。研究者评估了变异FTMT是否会通过干扰野生型FTMT的组装而产生主导的负面影响。并进行了变性-再变性实验，将恒定量的变性野生型FTMT与不同量的变性变体混合并再变性。通过蛋白质带密度定量分析发现，不断增加的变异亚基并不影响野生型FTMT的重新折叠特性。因此，该变体的显性负面效应的缺失使得野生型FTMT的正确组装成为可能。这些结果表明，突变可能导致FTMT的功能改变，而该功能改变可能是ARMD的病因之一。

因此，可以假设铁蛋白基因的野生型等位基因的存在可能足以补偿功能蛋白的量。然而，在视网膜这个特别暴露于氧化应激的组织中，FTMT的减少可能增强了线粒体对铁介导的氧化损伤，从长远来看可能与ARMD病理的发展有关。因此，该患者的FTMT基因突变的发现，不仅为临床治疗提供新的思路，它们还为探索ARMD的发展机制提供了新的线索，并可能成为研究结构-功能关系和阐明相应蛋白中尚不明确的功能的有趣实验试剂。

5 FTMT保护ARMD免受氧化应激

在ARMD中，铁可能作为自由基损伤的来源发挥作用。对于许多参与细胞代谢的许多蛋白质和酶来说(包括氧气运输、呼吸链电子转移、DNA合成和膜生物发生)，铁是一种必要的辅助因子。在视网膜中，铁被脂肪酸去饱和酶所利用，该酶参与膜的生物发生。RPE和神经视网膜脉管系统是参与铁运输的独立血液视网膜屏障。循环铁转铁蛋白复合物结合细胞表面转铁蛋白受体(transferrin receptor, TFR)，铁被吸收到细胞中，然后通过血-视网膜屏障转运到视网膜[16-17]。在与年龄有关的眼疾研究中，一项大型的多中心，随机对照的临床试验发现，饮食中添加抗氧化剂和锌可显着降低进展为晚期ARMD的进程。尽管研究表明ARMD的发病机制可能与氧化应激相关，但是自由基的来源还需进一步研究[18]。

Gao等[19]实验证明FTMT的水平不会因外源性铁而升高。但是当转染增加时，FTMT保留了高比例的铁，细胞显示出缺铁的迹象。所以研究者得出结论：铁对FTMT的潜在易得性与对胞质铁蛋白的易得性相同，而对FTMT 水平的控制可能为调节细胞铁稳态提供了一种强有力的方法。所以FTMT被证明可以显著调节细胞铁代谢，进而进一步影响着ARMD的发生与发展。FTMT保护线粒体免受氧化损伤的研究已经在其他疾病中取得了一些成就。FTMT过表达可以保护6-羟多巴胺诱导的多巴胺能损伤，可能在帕金森病中发挥重要的神经保护作用。Shi等[20]发现了FTMT对过氧化氢诱导的神经元细胞损伤的作用，FTMT的过表达显著保护了神经母细胞瘤免受过氧化氢诱导的凋亡，这是由于FTMT对细胞内ROS的增加和MMP的降低的限制作用，从而保护了细胞免受氧化应激介导的细胞凋亡。

对于FTMT保护线粒体免受氧化应激与ARMD相关的研究中，我们发现FTMT的抗氧化应激作用可能是由于铁离子的调节以及通过芬顿反应减少超氧自由基的产物所致，从而减少氧化应激的损害。最近，研究了一些FTMT基因被敲除的小鼠，但是，关于视网膜中缺乏FTMT的影响还需进一步研究。

6小结

ARMD是一种复杂的多因素疾病，具有人口、环境和遗传方面的危险因素;然而，即使近年来进行了大量的研究，其发病机制仍大部分未知。对于FTMT的研究，从分子生物学的角度探究FTMT在RPE细胞的蛋白质功能，阐释其在ARMD发病和疾病进展中的作用。借此增进对该疾病的病理生理机制的认识，以求更有效的治疗ARMD的方法。FTMT作为一种储存性铁蛋白，目前的研究主要集中在神经功能退行性疾病中，对于眼科相关研究处于起步阶段。现今以及未来的研究将从根本上回归疾病的本质，寻求疾病的致病原因，以期从根本上找到治疗和干预ARMD发生的靶点。尽管目前对于ARMD与FTMT关系的研究较少，但是它已经展示出了广阔的应用前景。我们希望未来能够探索出更多的发展机制，为预防甚至降低ARMD的发生率做出更大的贡献。