TNF-α、MMP-9在OA滑膜组织中表达及其意义

陈德胜，张 晨，宋国瑞，刘子歌，郭凤英，李 燕

随着我国人口老龄化，骨性关节炎(OA)的发生率与日俱增，其病理特征主要为软骨组织最先发生退行性病变，继而软骨下骨硬化，并伴有滑膜炎性肥大及关节周缘骨质增生、骨赘形成[1]。OA是一个慢性退变性的病理改变，也是一个慢性进行性无菌性炎性反应的过程[2-3]。近期研究结果证实[4]，滑膜炎发生在整个OA的炎性反应的初始阶段，也可能是OA病程发生发展中重要的一个环节。滑膜炎性表现不仅仅与OA的临床疼痛症状及关节功能有关，而且与OA疾病严重程度呈正相关，可以预测关节软骨退变的病理程度。关节的滑膜组织由巨噬样滑膜细胞(Macrophage-like synovioytes)和纤维样滑膜细胞(Fibroblast-like synviocytes)两种细胞组成，巨噬样滑膜细胞是关节内的主要炎性细胞，其来源于血液循环中的单核巨噬细胞[5]。在正常的生理情况下，巨噬嗜样滑膜细胞促使炎性作用的较低，但是在发生病理改变时，巨噬样滑膜细胞立即参与炎性反应，合成分泌TNF-α、MMP-9等炎性介质，增加炎性介质活性，导致OA的加重[6]。本文通过选取OA行人工关节置换术去除滑膜组织病例作为研究对象，通过免疫组化检测OA滑膜组织中TNF-α、MMP-9的表达，探讨TNF-α、MMP-9与OA发生发展的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料： 选取2018年10月-2020年1月膝关节骨性关节炎患者行人工全膝关节置换术25例作为OA组，其中男性7例，女性18例；年龄54～78岁，平均年龄63.5岁。膝关节外伤患者行关节镜手术治疗12例，作为创伤组，其中男性9例，女性3例；年龄19～55岁，平均年龄33.4岁。OA组纳入标准：①近一个月内有反复的膝关节疼痛，X线片站立位或负重位示关节间隙变窄、软骨下骨硬化和(或)囊性变、关节边缘骨赘形成，年龄≥50岁，晨僵时间≤30 min，活动时有骨摩擦音(感)。②达到Kellgren&Lawrence分级标准Ⅳ级。③视觉模拟评分(VAS)≥4分。OA组排除标准：①存在可能引起膝关节疼痛的其他疾病，如类风湿性关节炎、痛风性关节炎、创伤性关节炎、肿瘤等；②合并严重的心、脑、肺、肝脏、肾脏、造血系统等疾病的患者；③合并系统性感染性疾病、自身免疫紊乱性疾病、慢性疾病的患者；④半年内有关节腔药物注射史的患者；⑤对金属有过敏反应的患者。创伤组纳入标准：①有明确膝关节急性外伤史；②有膝关节韧带、半月板等损伤，临床表现和MRI检查明确，需要手术治疗者；③中青年患者；④治疗过程可以配合者。创伤组排除标准： ①合并骨性关节炎者；②感染性关节病变、关节占位性病变等；③存在代谢性骨疾病等不适合行关节镜手术治疗的患者；④合并内科严重脏器功能不全无法耐受手术者。本研究已取得患者与患者家属的知情同意且获得宁夏医科大学总医院科研伦理委员会批准，医学伦理审批号：2015-019。

1.2 标本收集及处理：OA组取人工全膝关节置换术术中需要去除病变的滑膜组织。创伤组关节镜手术的需要去除的损伤游离的滑膜组织，放置10%中性多聚甲醛浸泡，制作成蜡块，以厚度为4 μm进行切片，烘干后备用。

1.3 苏木素-伊红(HE)染色：玻片放入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、无水乙醇Ⅰ、无水乙醇Ⅱ、不同浓度酒精中浸泡，用蒸馏水洗掉残留酒精；苏木素染色，自来水洗掉染液，盐酸酒精分化，自来水冲洗，用0.6%氨水返蓝，流水冲洗；置入伊红染液中染色；置入95%酒精I、酒精II、无水乙醇Ⅰ、无水乙醇Ⅱ、二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中脱水至透明；中性树胶对已脱水的切片进行封片。 采用Olympus DP70显微镜系统(Olympus，日本)进行组织形态学观察、拍摄。

1.4 免疫组织化学染色：切片入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ和不同无水乙醇中浸泡，自来水、蒸馏水冲洗； 3% H2O2孵育，0.01 mol/L柠檬酸缓冲液煮沸进行抗原修复，滴加羊血清于玻片封闭，PBS液冲洗，滴加一抗(TNF-α，MMP-9)孵育，4 ℃过夜，PBS冲洗3次，滴加二抗，37 ℃孵育，PBS冲洗，滴加辣根过氧化物酶标记链霉抗生物素蛋白稀释液，37 ℃孵育，DAB液静置数分钟，流水冲洗，苏木素液复染，流水轻洗，1%盐酸酒精分化，流水轻洗，碳酸锂返蓝，流水轻洗，95%乙醇、无水乙醇Ⅰ、无水乙醇Ⅱ、二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ浸泡，中性树脂封片。采用Olympus DP70显微镜系统(Olympus，日本)进行观察、拍摄和阳性细胞计数，将切片放置在40×10倍镜下，随机性选取5个视野观察，分别计数TNF-α，MMP-9在OA组及创伤组中关节滑膜组织的滑膜细胞的阳性细胞个数，以阳性细胞率(染色阳性的滑膜细胞个数/总的滑膜细胞个数×100%)表示蛋白的表达量。

2 结果

2.1 苏木素-伊红(HE)染色：OA组滑膜组织呈慢性炎性表现，并有绒毛样增生，可见较厚的滑膜衬里细胞层数增加较多，有大量单核细胞、巨噬细胞及淋巴细胞浸润，巨噬细胞和纤维细胞因增生而变大，滑膜绒毛有纤维化，可见滑膜细胞变现坏死；创伤组滑膜细胞及纤维细胞排列整齐，分布较均匀，可见较薄的滑膜衬里细胞层数较少，有少量淋巴细胞及单核细胞浸润，血管增生不明显(图1-图2，目录后)。

2.2 免疫组织化学染色(HIC)：阳性细胞主要在滑膜细胞胞浆和基质周围，OA组在滑膜组织中的TNF-α、MMP-9的表达明显高于创伤组(图3-图6，目录后)。如图所示，图中箭头所指分别为巨嗜样滑膜细胞胞浆和周围的基质中出现棕色或者棕褐色染为TNF-α及MMP-9阳性染色部位，OA组与创伤组有显著性不同。2组中TNF-α、MMP-9定量结果比较差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 2组TNF-α、MMP-9免疫组化染色结果

3 讨论

骨性关节炎(OA)是一种关节软骨破坏，软骨下骨硬化和滑膜无菌性炎性反应等渐进性、退变性关节疾病。临床主要表现为关节肿痛、畸形及活动障碍[7]。关节滑膜的炎性反应是OA早期最常见的表现，也是一种继发性反应性炎症[8]。有研究对OA病人早期阶段的膝关节功能结构动态观察结果提示[9]，滑膜炎症反应的程度可以作为膝关节结构功能改变和病变预后的一项指标，OA的早期病变进展变化和滑膜炎症反应程度呈一定的正相关系。此外，滑膜炎症反应在OA的降解级联反应中起着关键的作用[10]。

关节滑膜是关节重要的组成部分，主要由两种滑膜细胞组成。一是巨噬样滑膜细胞(Macrophage-like synovioytes)，来源于周围血液循环中的单核巨噬细胞，是关节内最主要的炎性细胞之一，在特异性免疫应答过程中，可以分泌诸如TNF-α、IL-1、MMP-9等多种炎性介质，这些介质可以在关节内促进炎性反应，从而导致OA加重。巨噬样滑膜细胞的数量与OA病变程度及疾病预后关系极为密切。二是成纤维样滑膜细胞(Fibroblast-like synviocytes)，在关节内起到滑液美透明质酸盐及粘多糖的合作与分泌[5]。滑膜组织中有多种细胞因子和炎性介质参与了OA病程的变化，其中TNF-α和MMP-9起着重要的作用[11]。

TNF-α是由激活的巨噬细胞和(或)滑膜细胞产生，具有抑制成骨细胞和增强破骨细胞的活性作用，是人机体内作用最重要的致炎因子之一[12]。TNF-α作为炎症反应的始动因子，加重炎症反应，导致关节软骨生存环境平衡紊乱变，软骨失去获得足够的营养而出现渐进性退行性改变。王文明等[13]，通过体外实验研究结果证实：10年内病程OA患者滑膜及外周血中TNF-α表达明显高于10年以上病程OA患者及骨折患者。宋鹏等[14]选取54例OA患者手术切除膝关节滑膜组织和正常膝关节滑膜组织，通过Western印记检测，结果OA患者的滑膜组织TNF-α蛋白表达明显高于正常组。

MMP-9是从人类的巨噬细胞中分离纯化获得的基质金属蛋白酶具有降解变性Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶、原、明胶的特异能力；此外，可以切割天然Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅺ型胶原蛋白[15]。MMP-9参与内皮细胞、上皮细胞和基质角质细胞核迁移等，特别是在破骨细胞中大量表达不仅表明MMP-9能降解细胞外基质还能导致骨质的破坏[16]。近期有研究证实[17]，在骨关节炎动物模型中检测了MMP-9的最低表达量并发现MMP-9在OA的晚期软骨中表达下降甚至未检测到MMP-9阳性细胞，可能与软骨减少有关。郭静等[18]采用原位分子杂交技术检测骨关节炎及正常对照关节软骨及滑膜MMP-9、IL-6 mRNA的表达水平，结果提示：MMP-9、IL-mRNA阳性表达的IOD值均高于正常对照组，表明MMP-9、IL-6mRNA在OA关节软骨与滑膜中呈高表达，二者对OA的发生发展可能起促进作用。

本文选用行人工全膝关节置换术的OA患者滑膜组织。病理学结果显示，OA的关节滑膜组织显示慢性炎性表现，并有绒毛样增生，可见较厚的滑膜衬里细胞层数增加较多，有大量单核细胞巨噬细胞及淋巴细胞浸润，巨噬细胞和纤维细胞因增生而变大。在OA关节中滑膜组织出现的炎症、增生和纤维化等是OA病理改变过程中的起始环节。滑膜组织的炎性反应也导致关节腔内环境平衡紊乱，使得合成类因子产生减少，导致关节软骨基质合成与分解平衡失调，从而出现软骨基质降解加剧，关节软骨侵蚀，最终关节软骨与骨组织发生退行性改变。此外，由于关节滑膜增厚，并在炎性刺激下滑膜形态发生改变，卷曲、皱折延伸到关节间隙，造成嵌顿，与上下关节软骨面之间相互摩擦挤压，加重关节软骨机械性损伤。这些病理改变均与前期骨关节炎滑膜炎性反应的病理结果相符合。免疫组化结果提示，OA关节滑膜组织中TNF-α、MMP-9的阳性细胞表达明显高于创伤组，表明TNF-α、MMP-9与OA的关节滑膜炎性病变程度有一定正相关性。关节滑膜组织的巨噬样滑膜细胞受到特异性免疫应答反应，进而分泌TNF-α、MMP-9等多种炎性介质，TNF-α、MMP-9是参与到骨性关节炎发生发展病理过程中，加速关节软骨细胞外基质分离、降解及关节组织结构破坏最为重要的炎性介质和细胞因子，还加剧了滑膜和软骨的退行性改变，加快了软骨破坏和滑膜纤维化。与此同时滑膜组织中的巨噬样滑膜细胞刺激分泌TNF-α，TNF-α可激活MMP-9，使其活性增加，进一步促进关节软骨基质的降解；TNF-α作为炎症反应的始动因子，又协同关节内巨噬细胞释放多种细胞因子和炎性介质，共同作用下，促进了炎性反应，从而加重OA病理改变。

因此，关节滑膜组织中的TNF-α、MMP-9与OA无菌性炎性病变呈正相关，滑膜炎症反应与OA的早期病变进展有密切关系，而作为存在于滑膜组织中炎性介质的TNF-α、MMP-9可能作为骨性关节炎发病过程中其中较为重要的作用，也为深入探讨OA发病机制提供了一定的研究基础。