宁夏沙枣叶乙醇提取物对哮喘模型小鼠氧自由基代谢及气道炎症的实验研究

王基云，王 丹，陆钊罡，姚 遥，李 娟，李艳芳，王 平，吴文利

沙枣叶为胡颓子属植物沙枣树(Elaeagnus angustifolia L.)的叶子。沙枣树原产于西亚和中亚[1]，广泛分布于阿富汗、俄罗斯南部、哈萨克斯坦、土耳其、伊朗及中国西北地区，具有治疗慢性支气管炎等作用[2-3]。本研究通过复制卵蛋白(OVA)致敏的小鼠哮喘动物模型，观察沙枣叶乙醇提取物对哮喘模型小鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)中炎性细胞、血清中IgE-免疫球蛋白(IgE)、白介素4(IL-4)及γ干扰素(IFN-γ)水平，肺组织中氧自由基水平，肺组织病理形态学的影响，探讨其改善哮喘模型小鼠气道炎症药理作用及机制。

1 资料与方法

1.1 一般材料:本试验于2016-2017年在宁夏医科大学基础学院实验室完成。选取健康BALB/c种小鼠，SPF 级，雌性90只，雄性20只，体质量18～22 g，由宁夏医科大学动物实验中心提供，动物合格证号:SCXK(宁)2011-0001。其中60只雌性小鼠用于实验分组，20只雌性小鼠和20只雄性小鼠用于最大给药剂量试验。

1.2 药品与试剂:①卵白蛋白:上海楷洋生物技术有限公司，批号131225；②氢氧化铝:天津市大茂化学试剂厂，500 g，批号20110901；③水合氯醛:天津光复精细化研究，批号CAN B035-Q；④地塞米松磷酸钠注射液:辰欣药业股份有限公司，1 mL:5mg 10支；⑤小鼠ELISA试剂盒:武汉博士德生物工程有限公司。

1.3 仪器:402型超声雾化器(上海鱼跃医疗设备有限公司)，680型全自动酶标仪(美国Bio Rad公司)，DP71显微镜照相系统(日本Olympus公司)。

1.4 沙枣叶乙醇提取物的制备:1.2 kg沙枣叶粉碎后，加3倍量80 %乙醇加热回流提取(1 h×3)，合并滤液，减压浓缩，得142.3 g(约285 mL)沙枣叶浸膏。

1.5 沙枣叶乙醇提取物最大给药剂量的测定[4]:健康BALB/c种小鼠40只，18～22 g，雌雄各半，分2组，按照制备方法制备沙枣叶乙醇提物共计135 g(0.5 g/mL)，按0.4 mL/只灌胃(最大容积，最大耐受量)，给药前禁食10 h，正常饲水。观察14 d，记录小鼠一般状况改变及死亡数。结果发现，给药后10～20 min呼吸加快，1 h后呼吸平稳。观察1周未见小鼠外观及行为有任何变化，未见小鼠死亡。因此灌胃最大耐受量为10.0 g/kg。按照10g/(kg·d)、5g/(kg·d)、2g/(kg·d) 计算实验组需要的浸膏量及配制浓度，用超声波震荡10 min后制备成混悬液，混悬液均现用现配，每次灌胃前充分震荡保障溶液均匀性。

1.6 哮喘模型复制[5-6]:除正常组外，其余各组分别在第1天、第7天和第14天腹腔注射致敏液0.5 mL/只(含5 mg OVA和15 mg 氢氧化铝)。第14 d开始，将小鼠分别置于相同大小的雾化箱内，以1%OVA溶液雾化激发，每次10 min，连续14 d正常组的致敏液和激发均以生理盐水代替。模型成功标准包括:①行为改变:出现抓耳挠鼻、烦躁不安、口鼻发绀、呼吸深快等症状；②病理学改变:肺泡组织结构破坏，出现黏液、水肿，炎症细胞浸润等典型表现。

1.7 动物分组及给药:将60只雌性BALB/c种小鼠称重后随机分为正常组、模型组、对照组[(地塞米松10mg/(kg·d)]和沙枣叶乙醇提取物高、中、低剂量组，每组10 只。激发当天开始，阳性组给予地塞米松，高、中、低剂量组分别给予10g/(kg·d)、5g/(kg·d)、2g/(kg·d)灌胃，连续给药14 d。

1.8 标本采集与检测:各组小鼠末次激发24 h后，测量小鼠体重，用4%水合氯醛(水合氯醛4 g，加入到96 mL无菌生理盐水稀释) 0.1 mL/10 g腹腔注射麻醉。①血液标本。摘眼球取血，含有40 μl肝素的抗凝管收集标本，静置 1 h，4℃ 2 000 rpm离心15 min分离血清存-80℃备测。采用小鼠ELISA试剂盒检测其IgE、IL-4、IFN-γ含量，严格按照试剂盒说明书操作。②肺泡灌洗液(BALF)。自小鼠颈部切开分离并暴露气管，结扎右肺，在左侧支气管置静脉穿刺套管针，用磷酸缓冲盐溶液(PBS)0.3 mL灌洗支气管肺泡，反复抽吸3次。4 ℃ 1 000 r/min离心10 min，取上清液存-80℃备测。下层所留沉渣，加入1 mLPBS重悬，取10 μl加入血细胞计数板，高倍镜下细胞计数，剩余细胞悬液2 000 r/min离心1.5 min，弃上清，取少许沉淀涂片，用瑞姬氏染液染色，镜下分类计算嗜酸粒细胞、单核细胞、巨嗜细胞、中性粒细胞(高倍视野，计数200个细胞)。③肺组织。打开胸腔切取左肺称重后匀浆，制备成10%悬液，离心后取上清液。采用小鼠ELISA试剂盒检测其SOD、MDA、NO含量，严格按照试剂盒说明书操作。切取的右肺组织用0.9%氯化钠注射液洗净，10%甲醛固定，常规脱水，制作蜡块，切片后进行HE染色光镜下观察病理变化。

2 结果

2.1 BALF中白细胞计数及各组炎症细胞分类比例变化：模型组除中性粒细胞比率外，嗜酸性粒细胞、单核细胞比率及白细胞总数均较正常组明显增高(P<0.05)。正常组除中性粒细胞比率外，嗜酸性粒细胞、单核细胞比率及白细胞总数均较模型组明显降低(P<0.05);沙枣叶乙醇提取物高剂量组白细胞总数、嗜酸性粒细胞及单核细胞比率较模型组降低(P<0.05)、中剂量组除单核细胞比率外，白细胞总数以及嗜酸性粒细胞比率较哮喘模型组降低(P<0.05)。沙枣叶乙醇提取物高、中、低剂量组均可显著升高中性粒细胞比率(P<0.05)，见表1。

表1 各组BALF中白细胞计数及各组炎症细胞分类比例比较

2.2 小鼠肺组织中SOD、MDA和NO的含量变化：模型组与正常组比较，SOD含量降低(P<0.05)，MDA及NO含量升高(P<0.05)。沙枣叶乙醇提取物高、中剂量与模型组比较，SOD含量升高(P<0.05)，高、中、低剂量组均可降低MDA和NO含量(P<0.05)，见表2。

表2 各组小鼠肺组织中SOD、MDA和NO含量的比较

2.3 小鼠血清中IgE、IL-4及IFN-γ的含量变化：模型组与正常组比较，IgE、IL-4含量升高 (P<0.05)，IFN-γ含量降低 (P<0.05)，IL-4/IFN-γ值升高 (P<0.05)。沙枣叶乙醇提取物高、中剂量组及对照组与模型组比较，IgE、IL-4含量降低 (P<0.05)，高剂量组和对照组IFN-γ含量升高(P<0.05)，同时高、中剂量组和对照组血清中IL-4/IFN-γ值降低(P<0.05)，见表3。

2.4 肺组织病理学变化：①正常组:小鼠肺泡组织结构完整，清晰，呈现正常肺组织形态。②模型组:小鼠肺泡组织结构破坏，不完整，不清晰，气道黏膜腺体分泌旺盛，气道可见大量黏液，周围组织水肿，黏膜下大量炎症细胞浸润。③对照组:小鼠肺泡组织结构完整，管壁基本光滑，气道可见少量黏液，黏膜下可见少量炎症细胞浸润，见图1(目录后)。④沙枣叶乙醇提取物高、中剂量实验组:气道结构完整，管壁基本光滑，气道可见少量黏液，黏膜下可见少量炎症细胞浸润，见图2和图3(目录后)。可见对照组与沙枣叶乙醇提取物高、中剂量实验组较模型组有明显改善。⑤沙枣叶乙醇提取物低剂量实验组:气道结构不完整，腔形稍不规则，管壁不光滑，黏膜腺体分泌较旺盛，气道可见大量黏液，黏膜下多量炎细胞浸润，见图4(目录后)。

表3 小鼠血清IgE、IL-4、IFN-γ含量的比较

3 讨论

哮喘是多种细胞包括嗜酸粒细胞、肥大细胞、淋巴细胞、中性粒细胞、平滑肌细胞、气道上皮细胞等，以及细胞组分参与的气道慢性炎症疾病[7]。已有研究表明活性氧与哮喘有关，体内过度产生(ROS)可导致氧化抗氧化失衡，产生的自由基可引起气道高反应导致气道炎症[8]。而哮喘炎症机制中T细胞等炎症细胞与炎症介质有相关性，分别发挥抑制调解作用或加重哮喘发作。大量证据表明，Th1/Th2免疫失衡是哮喘发病机制中的重要环节[9-10]，Th2细胞分泌的IL-4可与IL-5、IL-9等多种细胞因子促进嗜酸细胞粒细胞炎症反应及浆细胞释放免疫蛋白(IgE)，而IgE又可促进组胺、白三烯等多种炎症递质的释放，引起支气管痉挛、黏膜水肿、黏液分泌增加等，从而导致哮喘[11]。Th1细胞分泌的IFN-γ可以抑制由 IL-4诱导的B淋巴细胞增值和分泌IgE、诱导单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、血管内皮细胞等表面抗原的表达，促进 Thl 细胞分化，抑制 Th2 细胞反应[12]。本研究模型结果显示，模型组小鼠肺组织SOD含量与正常对照组相比呈显著性下降，MDA含量显著增加。血清中IL-4、IgE含量升高，IFN-γ含量降低，IL-4/IFN-γ值升高。同时BALF中白细胞总数、嗜酸性粒细胞比率升高，病理结果可见模型组气道黏膜腺体分泌旺盛，气道内可见大量黏液，炎症细胞浸润，说明哮喘模型小鼠机体内氧化应激产生大量ROS，参与炎症反应，同时Th1/Th2系统出现免疫失衡，哮喘小鼠模型制备成功。目前研究表明,沙枣叶中含有黄酮类化合物[13-14]，且叶子中的含量要高于花的含量[15]，体外实验证实沙枣叶具有体外抗氧化性[16]，体内实验证实沙枣叶对小鼠肝脂质过氧化具有保护作用和良好的抗脂质过氧化作用[17]，OKMEN G等[16]报道沙枣叶甲醇提取物对小肠结肠炎耶尔森菌及鼠伤寒沙门氏菌TA100具有一定的抑制作用。前期对沙枣花研究发现其含有黄酮类化合物[17]，具有抗氧化作用[18-20]，可以通过调整体内的氧化与抗氧化系统改善哮喘的气道炎症[21]，而Ge Y 等[22]观察沙枣花水提取物能显著延长豚鼠惊厥前时间(P<0.05)，延长咳嗽潜伏期(P<0.05)，降低氨水所致小鼠咳嗽频率(P<0.05)，提高小鼠气管酚红输出量(P<0.05)。

本实验发现经沙枣叶乙醇提取物高、中剂量组干预后,哮喘模型小鼠肺组织细胞炎性浸润等病理有明显减轻的改变，肺组织中SOD、NO、MDA水平基本恢复正常，与文献报道体外及体内抗氧化作用吻合，而高、中剂量组血清中IL-4、IgE、IFN-γ含量明显改善，因此，沙枣叶乙醇提取物有维持哮喘模型小鼠氧自由基生成与清除的动态平衡，调节Th1和Th2的平衡而达到抗炎、平喘效果，这可能是改善哮喘模型小鼠气道炎症作用机制之一。