血DAPK和MGMT DNA水平对肺癌转移的相关性

马会博 杜晶晶

肺癌是最常见的肺原发性恶性肿瘤，多在40岁以上发病，在男性中的发病率多于女性[1]。其中非小细胞肺癌（non-small-cell lung cancer，NSCLC）为肺癌的主要类型，临床表现主要为隐匿起病、迅速发展，大部分患者在确诊以后已进入晚期，预后的生存期短[2，3]。若NSCLC在发生早期时就能诊断出，并将病灶完全切除，可显著提高患者的5年生存率。NSCLC的发病因素较多，但具体机制还未明确[4]。影像学技术在NSCLC早期筛查中未能显示出良好的效果，且诊断效果易受到主观因素的影响。一般的病理学检验是对肺癌的组织样本进行检验，使得患者受到创伤，且组织样本的收集较复杂[5，6]。现代研究表明DNA甲基化在细胞癌变过程中发挥重要作用，DNA甲基化可细胞周期、DNA修复，致癌物代谢，细胞黏附，凋亡等，诱导恶性肿瘤的发展[7，8]。有研究显示，在NSCLC患者，抑癌基因启动子区CpG岛呈现不同程度的甲基化，并由此出现转录沉默[9-11]。所以，对DNA甲基化分子标志物进行检测，有利于深刻了解NSCLC的发生发展机制，在诊断早期肿瘤时提供参考。本文探讨血DNA甲基化分子标志物水平对肺癌转移特征的相关性，现报道如下。

资料与方法

1 研究对象 于2015年1月～2018年2月，采用回顾性方法，选择在本院诊治的NSCLC患者78例作为观察组（病理学诊断为NSCLC），同期选择在健康体检者100例作为对照组。纳入标准：两组入选者均知情同意；NSCLC患者术前未经放疗、化疗；临床与检测资料完整；伦理委员会审批通过本次研究。排除标准：患者不具备完整的临床资料；哺乳期、妊娠期妇女；心肾功能不健全的患者；有出血倾向、出血性疾病的患者。

观察组中男50例，女28例；平均年龄（55.25±11.11）岁；平均体重指数（22.19±2.93）kg/m2；平均病程（5.22±1.48）年；肿块大小：≥3 cm 40例，＜3 cm 38例；淋巴结转移32例，远端转移20例；组织学类型：腺癌38例，鳞癌40例。对照组中男60例，女40例；平均年龄（55.11±9.82）岁；平均体重指数（22.88±2.11）kg/m2。两组在体重指数、性别等方面的差异无统计学意义（P＞0.05）。

2 血液标本采集 取两组入选者的空腹静脉血5 mL，用真空采血管柠檬酸钠收集，在采血2 h以内将血浆分离。于4℃ 3 000 g，首次离心10 min取上层血浆；4℃ 8 000 g 第2次离心15 min获得无血细胞成分的纯血浆，分装后置于-80℃备用。

3 DNA甲基化分子标志物检测 采用血液基因组DNA提取试剂盒获得血液样本DNA，采用PCR法扩增目的基因，候选基因为DAPK和MGMT基因。MGMT基因甲基化的上游引物表现出的序列是：5'-CTGCCCTACTTATGGATGGG-3'，而下游引物的序列是5’-CTGGATTGTAGCAGATCATGC-3'。DAPK基因甲基化上游引物序列为：5'-CCATGTACGTTGCTATCCAG-3'，下游引物序列为5'-CCCCAAGGCCAACCG'。将β-actin（519 bp）做内参，引物由上海生工公司合成，DAPK和MGMT基因扩增片段为193 bp和198 bp。

PCR扩增：94℃预变性5 min；94℃变性1 min，72℃时延伸30 s～1 min，55℃时退火25～30s，35次循环；72℃时延伸10 min，4℃下保存，对PCR扩增产物，分析琼脂糖凝胶电泳结果。若甲基化引物扩增有条带（凝胶电泳有条带）说明该样本发生了甲基化。

4 统计学处理 应用SPSS20.00软件，使用均数±标准差（ ±s），采用t检验，计数数据以构成比表示，采用χ2检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

结 果

1 DAPK和MGMT甲基化水平对比 观察组中血浆样本DAPK和MGMT甲基化比例为51.3%和53.8%，对照组分别为14.0%和15.0%，以观察组高于对照组（P＜0.05）。见表1与图1、2。

2 相关性分析 在观察组中，血浆DAPK和MGMT甲基化与病理组织学类型、淋巴结转移、远端转移的相关性有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表1 两组血浆样本DAPK和MGMT甲基化水平对比（n）

讨 论

NSCLC是临床常见的恶性肿瘤之一，其死亡人数超过了乳腺癌、结肠癌、前列腺癌的总和，当前在我国发病率和死亡率均呈明显上升趋势[12]。该病的发病年龄高峰在60～79岁，男女之比为2.13∶1。虽然通过药物、放射及手术可以治疗早期肺癌，然而5年存活率始终低于20%。尤其是NSCLC存在肿块过大、多发病灶等症状，导致术后极易复发，因此，这就需要增强临床早期诊断[13，14]。早期用于NSCLC诊断的方法多为胸部X线等影像学方法，虽然检出的敏感性高，但是特异性差，很难降低NSCLC的死亡率。病理学检查对于患者的创伤较大，早期筛查效果不太适合[15，16]。

表2 血浆DAPK和MGMT甲基化与NSCLC患者病理学特征的相关性（n=78）

伴随分子生物技术飞速发展，在早期诊断NSCLC时，可以提供特异性分子标志物。特别是NSCLC从不具备侵袭发展到侵袭性需要较长时间，而此期间就为NSCLC提供了诊断窗口[17]。所谓DNA甲基化是指DNA甲基的转移酶对生物体起到催化作用，将s-腺苷甲硫氨酸当作甲基供体，把甲基转移至特定碱基这一过程[18]。通常在肿瘤的形成过程中发生DNA甲基化，特别是DNA甲基化作为分子标志物可以经PCR法扩增；其也可以从远离肿瘤的外周组织中分离出来，也使诊断NSCLC成为可能。本研究观察组中血浆样本DAPK和MGMT甲基化比例为51.3%和53.8%，对照组分别为14.0%和15.0%，观察组高于对照组（P＜0.05）。MGMT作为DNA修复酶，是最近才被发现的新酶，能够引起化剂化疗类药物的失效或失敏，在肿瘤细胞中有较高表达，引起肺癌细胞及组织对烷化剂类药产生耐药性，进而对治疗及预后效果产生影响[19]。在肿瘤细胞中，MGMT分子包含烷基受体2个，能够接纳烷基化损伤的DNA中6-烷基鸟嘌呤包含的烷基，对于被烷基化鸟嘌呤起到修复作用，对DNA交联形成起到限制，继而削弱细胞毒[20]。死亡有关的蛋白激酶（DAPK）能够有效调节细胞凋亡，定位于人染色体9q3411，其蛋白定位于肌动蛋白微丝中，而生物学作用大多与细胞凋亡密切相关，能够利用多条通路对细胞凋亡起到诱导作用[21]。

由于诊断技术限制，在诊断NSCLC时，大部分患者已进入中晚期，术后的5年生存率一直徘徊在15%左右[22]。DNA甲基化是NSCLC发生发展阶段的早期事件[23]。且极易获取外周血，外周血游离DNA的甲基化检测可作为早期检测的最佳介质，NSCLC患者血浆的游离DNA出现甲基化，将血浆游离DNA作为检查介质时，欠缺组织特异性。本研究显示，观察组中血浆DAPK和MGMT甲基化与病理组织学类型、淋巴结转移、远端转移有相关性（P＜0.05）。DAPK基因是一种调节细胞凋亡的正向调控因子，其甲基化可以导致DAPK基因表达下降或失活，在细胞凋亡与疾病发生过程中起重要作用[24]。MGMT基因作为修复基因，能够修复受损DNA，该基因的甲基化能够使表达下调，诱发恶性肿瘤的发生[25]。不过本研究也存在一定的缺陷，如样本数目不够，将在下一步研究中扩大样本量，以提高结果的科学性，同时通过高通量的手段筛选出更有价值的分子标志物。

综上所述，DAPK和MGMT甲基化与NSCLC患者病理特征有明显相关性。