基于质谱的呼气分析在新型冠状病毒肺炎诊断中的潜力和前景

刘宜平 郭雷 李恩有

哈尔滨医科大学附属第一临床医学院麻醉科150001

新型冠状病毒肺炎 (COVID-19),是严重急性呼吸综合征冠状病毒2 (severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-Co V-2)感染导致的肺炎,全球感染病例已超过640万,死亡病例超过了38万,在世界范围内带来了巨大的社会和经济影响[1]。对于引起COVID-19的SARS-Co V-2检测是COVID-19 诊断的重要标准。然而目前应用的分子检测方法对采样技术要求很高,而且具有较高的假阴性率和假阳性率,这对COVID-19的诊断产生很大影响[2-3]。

日前英国诺桑布利亚大学官网公布,该学校的科研团队研发了一种呼吸检测仪器,可以通过收集人们呼吸的气体来诊断是否感染SARS-Co V-2。这种仪器不仅能用于COVID-19诊断,还可以用于诊断其他肺部疾病。与传统的胸部CT 相比,呼吸诊断痛苦小,耗时短,易操作,这种仪器一旦成功投入使用,将大大革新全球COVID-19的诊断流程。虽然目前呼气分析用于诊断COVID-19的技术尚未实现,但是随着高分辨率质谱技术的不断进步,以及代谢组学方法用于诊断呼吸道疾病的大量研究[4-5],本文拟对基于质谱的呼气检测技术用于呼吸道病毒的诊断作一综述,以期为COVID-19的早期快速诊断提供一种新的研究思路。

1 呼气分析的样本类型

长期以来,人的呼吸及尿液和血液一直是评估人体健康和环境暴露的3种主要生物介质。正如希波克拉底在公元前400年所描述的那样,检测人类呼吸中的异味是第一个分析健康的评估工具。尽管与现代生物流体分析相比,呼气检测不那么普遍,但由于其采样是非侵入性的,采样时间和样本量不受限制,并且不需要临床专业技术人员,呼气检测已成为一种有吸引力的诊断方法[6]。呼气样本的类型包括气相呼气、呼气冷凝物 (exhaled breath condensate,EBC)和呼气气溶胶 (exhaled breath aerosol,EBA)。

1.1 气相呼气 传统的呼气检测样本大多数为气相呼气。人体吸入和暴露后,挥发性有机物 (volatile organic compounds,VOCs)会保留在人体的不同部位,具体取决于它们的气体-血液-脂肪分配系数[7]。VOCs可以由吸入、口服或皮肤吸收 (例如汽油、食物、乳液)引起的外源性环境暴露或来自体内的内源性代谢产物 (例如微生物代谢、癌性肿瘤)产生[8]。肺泡气仅由呼吸末的350 ml气体组成,目前已经有许多呼气采样技术可以仅收集肺泡气[9]。

1.2 EBC 呼吸道的所有部位直至肺泡表面都被黏液层覆盖,该黏液层可以被雾化并携带各种非挥发性成分[10],EBC是将多次呼吸通过冷管后回收冷凝物,它提供了以前未知的全新化合物[11]。通过EBC 的酸碱度 (p H 值)检测已开发了 “在家”收集和监测的儿童支气管哮喘状态的方法[12]。EBC分析的另一个应用是对机械通气患者收集冷凝物,这对于不能多次采集血液或尿液的早产儿[13]以及评估ARDS的机械通气患者[14]都非常重要。

1.3 EBA EBA 代表总EBC 的一部分,并针对较大的分子,例如脂肪酸和细胞因子,以及蛋白质,病毒和细菌[15-17]。该技术具有采样方法简单的优势,受试者只需在给定的时间 (如10 min)内佩戴标准的医用口罩,即可将其运回实验室并进行各种目标化合物分析。除生物介质外,还可以使用EBA 检测颗粒物和纳米颗粒,例如人们发现职业接触二氧化钛和氧化铁纳米颗粒的员工在EBC 样品中显示出明显增加的钛和氧化应激标志物[18]。EBA 还可用于识别疾病的特征性指纹谱,细菌、病毒和健康个体的指纹谱都可以通过分析EBA 来区分[19-20]。

2 常用的呼气检测质谱技术

质谱 (mass spectrometry,MS)是一种测量离子质荷比的分析技术,适用于纯样品以及复杂的混合物分析。在经典的MS过程中,通过用电子轰击将固态、液态或气态样品电离,导致样品中的某些分子破裂成带电的片段,或者只是变得带电而没有碎裂。然后根据这些离子的质荷比将它们分离。常用的呼吸检测的质谱技术包括气相色谱-质谱 (gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)、液相色谱-质谱 (liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS)、直接质谱及其他软电离质谱技术。

2.1 GC-MS技术 GC-MS是目前大部分呼气检测应用的技术,这种方法的优势在于可以同时分析多种呼出气VOCs的准确水平及在不同人群中的差异,快速确定疾病特异性的VOCs种类。气相色谱飞行时间质谱仪 (time of flight,TOF)较传统的GC-MS更快,以其高分辨率和准确度获得数据[21]。Peralbo-Molina等[22]最近开发了一种利用液-液萃取和气相色谱飞行时间质谱仪 (gas chromatography-time of flight-mass spectrometry,GCTOF-MS)进行代谢组学分析EBC 样品的方法,并证实了EBC样本作为区分肺癌和危险因素组生物介质的潜力。Schnabel等[23]比较了疑似呼吸机相关性肺炎患者的呼吸样品,鉴定出区分患病组和非患病组的12 种VOCs。GCTOF-MS也已用于分析嗜酸性粒细胞和嗜中性粒细胞的细胞顶空,以鉴定与炎症和氧化应激相关的VOCs[24]。二维气相色谱结合飞行时间质谱是一种更有效的高分辨率多维技术,它的应用增加了呼吸样品中可检测到的VOCs数量。多维气相色谱与一维气相色谱相比具有更大优势,因为它使用2个毛细管气相色谱色谱柱分离共洗脱的VOCs,并将代谢组学中VOCs的覆盖范围增加了一个数量级[25]。在Philips等[26]的一项研究中,从健康志愿者的肺泡呼吸样品中鉴定出2 000种VOCs,其中一些以前从未在呼吸中检测到。

2.2 LC-MS技术 除了GC-MS外,LC-MS经常被用于分析呼吸和EBC样品,尽管可以使用GC-MS仪器相对容易地分析呼吸样本,但EBC 和EBA 样品基质中组分的浓度较低,需要大量的制备程序,这使这些样品比呼气更难操作[27]。EBC和EBA 样品均可以液体形式获得,因此适用于LC-MS分析。样品可以直接注入仪器中,也可以提取以进一步分析。由于保留时间漂移较大,LC/MS数据的可变性较大[28],具有高分辨率的MS,例如四极杆飞行时间串联质谱或Orbitrap质谱,增加了呼气样品非靶向分析的可靠性。已有多项研究使用高分辨率LC-MS分析EBC 样品的蛋白质谱[29-30]。Muccilli等[29]从9名健康受试者中采集EBC样品,使用Orbitrap-Elite质谱仪对消化的蛋白质进行LC-MS/MS分析并鉴定出163种基因产物。Fumagalli等[30]使用线性离子阱静电轨道阱组合式高分辨质谱对来自非吸烟者、健康吸烟者以及患有COPD 的EBC样本进行了区分。

2.3 直接质谱技术 质子转移反应质谱法直接质谱技术是一种快速直接的质谱方法,能够以呼吸到呼吸的分辨率进行实时分析。在直接质谱技术中,万亿分之一水平的检测限已经实现。某些直接质谱技术仪器包含四极质量分析仪,其已用于评估呼气VOCs,以及来自糖代谢的碳酸醇和短链脂肪酸的VOCs[31]。选择离子流动管质谱使用正离子(H3O+、NO+和 O2+)或 负 离 子 (O-、OH-、O2-、NO2-和NO3-)试剂的化学电离提供呼吸中VOC的实时测量,检测限达到万亿分之一,使其成为快速分析的灵敏技术[32]。离子迁移谱仪器结构紧凑,对于检测十亿分之一浓度以下的醛和酮有较大优势[33]。由于其体积小和便携性的优势,使其更适合于现场检测[34]。离子迁移谱还可以用于监测麻醉过程中使用丙泊酚镇静患者的呼出气痕量丙泊酚浓度[35]。

2.4 其他软电离质谱技术 自20世纪80年代,随着电喷雾和基质辅助激光解析等 “软电离”技术的出现,质谱开始用于分析高极性、难挥发和热不稳定样品,尤其适用于蛋白质序列分析和翻译后修饰分析。电喷雾电离技术由Masamichi Yamashita和John Fenn 于1984 年首次报道,这种用于生物大分子分析的技术获得了2002年诺贝尔化学奖[36]。它解决了大分子在电离时易碎的问题,因此适合于大分子离子检测,并且溶液液相信息可以保留在气相中。由于其MS中仅能获得非常少的结构信息,因此常将电喷雾与串联质谱耦合以克服此缺点。基质辅助激光解吸/电离(matrix-assisted laser desorption/ionization,MALDI)与电喷雾电离的特征相似,它的原理是使用激光能量吸收基质,从具有最小碎片的大分子中产生离子。MALDI最广泛使用的质谱仪类型是TOF,这是因为它检测的质量范围很大,同时TOF检测程序也非常适合MALDI电离过程。

3 质谱技术用于呼吸道病毒的诊断

由于病毒能够影响宿主的代谢途径,例如糖酵解、磷酸戊糖途径、谷氨酰胺分解及脂肪酸合成,因此病毒感染后的VOCs可能发生变化[37]。2010年Phillips等[38]首次报道了减毒活流感疫苗接种对呼吸中氧化应激产物的影响,发现健康人的减毒活流感疫苗接种引起了氧化应激的呼吸生物标记物的持续增加。2014 年Aksenov等[39]应用GCMS研究了人鼻病毒感染的体外气道细胞的VOCs,随后Abd等[40]研究了从5种病毒 [甲型流感病毒 (Influenza A virus,IAV)甲型流感、乙型流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒和副流感病毒]以及3种细菌 (卡他莫拉菌、流感嗜血杆菌和肺炎军团菌)的培养物和菌落VOCs中,鉴定出与感染细菌有关的2种重要的VOCs,即庚烷和甲基环己烷。2018年Purcaro等[41]应用顶空固相微萃取——全二维气相色谱飞行时间质谱法得到了病毒感染细胞的指纹图谱,并评估了2种重要的呼吸道病毒,即呼吸道合胞病毒和IAV,结果在呼吸道合胞病毒和感染的细胞培养物中均观察到碳氢化合物过量。这一发现与增加的氧化应激结果相一致,因此断定氧化应激与呼吸道病毒感染有关。Traxler等[42]应用GC-MS分析了感染IAV 的猪的呼出气VOCs,发现6种VOCs可能与疾病进展有关,包括乙醛、丙醛、乙酸正丙酯、甲基丙烯酸甲酯、苯乙烯和1，1-二丙氧基丙烷。随后其研究团队在2019 年分析了IAV 和化脓性链球菌共感染的细胞的VOCs[43],认为乙醛和丙醛的排放增加反映出细菌感染,乙酸正丙酯与病毒感染有关。Schultz等[44]应用LC-MS/MS检测IAV 感染猪模型的免疫相关脂质组 (类花生酸)学影响,结果发现IAV 感染会导致所分析的羟基二十碳三烯酸、羟基二十二碳六烯酸和环氧二十碳三烯酸的水平发生集体变化。

近日来几项研究先后报道了LC-MS用于检测SARSCo V-2 病毒相关蛋白。Gouveia 等[45]应用串联质谱法在SARS-Co V-2病毒的体外研究中发现,受感染Vero细胞存在6个病毒蛋白的101 个肽段,并提出14 种肽的候选清单,可用于靶向质谱检测的开发以及SARS-Co V-2的诊断。Gordon等[46]在人体细胞中克隆、标记、表达了26 种SARS-Co V-2蛋白,并应用组合型四极杆Orbitrap质谱鉴定了与每种蛋白物理相关的人类蛋白,结果他们确定了66种可药物化的人类蛋白,并筛选了两套具有抗病毒活性的药物,这可能会研发出治疗COVID-19 的有效方案。Shajahan等[47]应用高分辨率质谱对人细胞表达刺突蛋白亚基S1和S2的糖基化定位,表征了棘突蛋白上的定量N-糖基化谱并观察到S1受体结合域上意想不到的O-糖基化修饰,这可能推动疫苗的研发。

电喷雾质谱技术也可以有效地用于检测病毒病原体[48-50]。Sampath等[48]应用PCR 结合电喷雾质谱技术对9种不同冠状病毒,包括SARS-Co V 进行检测。他们提出该方法可以在所有3 种人类病毒的混合物中识别和区分SARS和其他已知冠状病毒,包括人类Co V 229E和OC43。Cordey等[49]开发了RT-PCR/电喷雾电离质谱技术并对流感病毒进行检测和分型,该方法针对201个IAV 或乙型流感病毒感染的鼻咽拭子的分型进行了评估,结果显示RTPCR/电喷雾电离质谱技术对所有样本检测率分别为91.3%和95.3%,在所有不可分型的标本中均显示出低病毒载量。随后Mengelle等[50]应用此PLEX-IDTM系统对流感病毒及其亚型进行了检测,并与RespiFinder®试剂盒鉴定的流感病毒进行比较,结果显示PLEX-IDTM系统的敏感度、特异度、阳性和阴性预测值分别为87.4%、96.5%、92.2%和94.1%。使用AnyplexTMⅡRV16检测试剂盒进一步对13个结果不一致的样品检测发现,7个与RespiFinder®一致,而6个与PLEX-IDTM一致。

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪 (matrixassisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)已经成为微生物鉴定和诊断的潜在工具。许多研究人员已经证明了MALDI-TOFMS用于诊断流感病毒、肠病毒、人乳头瘤病毒、疱疹病毒、肝炎病毒等临床传染性病毒样本的实用性[51-53]。在大多数研究中,采用了通过PCR 扩增病毒遗传物质,并通过MALDI分析/鉴定扩增子的方法。Sjöholm 等[51]报道了一种基于MALDI-TOF-MS的高效筛选方法,用于多重检测存在于不同档案生物学样品中的所有人类疱疹病毒,他们证实MALDI-TOF-MS方法对病毒的敏感性和检出限很高,可与寡核苷酸微阵列和多重PCR 等参考方法相媲美。Yi等[52]报道了使用基于PCR 的MS方法检测高危型人乳头瘤病毒,他们表明该方法的高检出率和低成本效益使其适合于常规临床环境中的诊断和流行病学研究。Piao等[53]将多重PCR 与MALDI-TOF-MS联合使用,可同时检测出8种与人类肠道感染相关的病毒。Calderaro等[54]证实MALDITOF-MS是一种有效,快速且廉价的工具,可从不同的临床样品中鉴定出多种脊髓灰质炎病毒血清型。他们进一步研究发现,通过MALDI-TOF-MS可以检测到特定的病毒生物标志物,这些标志物有助于将病毒感染的细胞与健康细胞区分开[55]。多篇文献报道了MALDI-TOF-MS可用于甲型流感、狂犬病毒以及克里米亚-刚果出血热病毒的诊断[56-58]。北京协和医院金奇课题组应用多重PCR 结合MALDI-TOF-MS技术在241 个样本中快速检测与手足口病相关的病毒[59],随后又将其用于21 种呼吸道病毒的诊断[60]。该课题组在2017年应用其建立了通用冠状病毒筛选方法[61]。由于分子检测方法往往针对一个基因,而冠状病毒的基因型会发生变异,导致检测的假阴性率,该课题组建立的冠状病毒筛选方法能够靶向2个或4个基因,从而提高冠状病毒的诊断率。不足是该方法基于已知的冠状病毒序列,仅使用该方法很难检测到未知的人冠状病毒。

4 前景展望

呼气分析是一种无创的、简便的反映机体健康或疾病的分析方法,呼气中的蛋白质和VOCs等生物标志物具有诊断病毒感染的潜力。近日来国际上已开展多项呼气分析用于COVID-19诊断的注册研究,例如美国梅奥医学中心(NCT04341012)及英国剑桥大学 (IRAS ID：237557)等,虽然尚未开发出快速诊断COVID-19的仪器,然而MS技术在诊断其他类型流感病毒以及2003 年的SARS-COV方面都证明了其较高的敏感度,这为COVID-19病毒检测方法的研发提供了重要的研究基础和理论依据。随着高分辨质谱技术的不断发展以及科研人员的研究,呼出气VOCs检测有望成为诊断COVID-19的快速方法,然而在此之前还需要大量的基础研究。未来人们可以通过将体外研究病毒本身特征性VOCs与体内研究病毒感染后机体氧化应激等产生的VOCs相结合的方法,以鉴定SARS-Co V-2感染相关的呼出气VOCs并定性定量,进而实现非侵入性快速检测SARS-Co V-2,尤其适用于机场等现场检测,这对于COVID-19的早期快速诊断具有十分重大的意义。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突