单细胞分析在呼吸系统疾病中的研究进展

王谙 吴琦 陈怀永

天津医科大学海河临床学院 天津市肺脏再生医学重点实验室300350

呼吸系统疾病病死率在世界范围内逐年上升,每年约有700多万人死于呼吸系统疾病［1］。这些疾病通常是细胞内在突变、细胞间作用改变、对环境损害的异常应答、细胞类型比例失调以及组织结构紊乱的综合结果［2］。已有报道称,肺中存在40余种细胞类型［3］。最近有关学者在人类气道壁上发现了一种丰度很低的新型上皮细胞类型——离子细胞［4］,这得益于单细胞测序技术强大的分析功能。单细胞测序技术通过转录组扩增进行高通量测序,揭示单个细胞的基因表达状态,反映细胞间的异质性和动态互作,把组织病理学推向单细胞水平［2］。全面而深入地解析人类肺组织及呼吸系统疾病模型动物肺脏所有细胞类型、功能和互作关系,有助于人们理解肺脏功能的基本原理,揭示呼吸系统疾病发生与发展的机制。

1 单细胞测序技术

作为单细胞系统生物学的一部分,单细胞测序的原理是将分离的单个细胞的微量遗传基因进行扩增,获得高覆盖率的完整的基因组后,再进行高通量测序,用于揭示细胞群体差异和细胞进化的关系。单细胞测序已成为检测细胞间基因异质性的重要工具,它将计算科学、数学模型和高通量技术与细胞的生物学功能结合起来［5］。2002年,多项研究报道单细胞转录组的基因芯片分析［6-9］。虽然基因芯片使全面分析单细胞转录组成为可能,但是它只能检测已知基因,而且检测的灵敏度和动态范围均有限［10］。2009年,Tang等［11］通过对小鼠的单个卵母细胞进行分析,首次报道单细胞转录组的深度测序分析 (single cell RNAsequencing,scRNA-Seq)。2012 年,Wang 等［12］通 过 单 细胞测序的方法,测定100个精子的重组率,发现许多新的重组热点。2013年,Ni等［13］首次利用癌症患者外周血单个循环肿瘤细胞进行全基因组和外显子组测序,为肿瘤无创诊断和监测提供了一种新的技术手段。单细胞测序技术能够解析细胞间更加细微的差异,推动肿瘤、微生物、神经科学、免疫等领域的发展,正在成为生命科学研究中的热点［14］。从2016 年开始,scRNA-Seq技术被逐渐引入到呼吸系统疾病研究中来。

2 单细胞分析在肺发育研究中的应用

对肺脏功能的研究中,单细胞测序技术有助于解析肺脏发生过程中的细胞进程,定义间充质、上皮和单核/巨噬细胞群体之间的细胞异质性。Treutlein等［15］利用单细胞转录组测序分析小鼠远端肺细胞类型。对198个不同分化阶段的小鼠肺上皮细胞进行聚类分析,能有效区分远端肺上皮细胞的各个类型,并发现了上皮细胞的多个新标志物。重建了双潜能前体细胞沿2个肺泡谱系成熟的步骤,阐明了Ⅱ型肺泡上皮细胞谱系发生过程。Lee等［16］使用了基因谱系追踪、单细胞RNA 测序和类器官培养等技术,在小鼠肺中鉴定出2个支持上皮干细胞生长的间质细胞群。这两群间质细胞分别表达Lgr5 和Lgr6,分布的部位也不相同。这种对上皮细胞和其邻近间质细胞之间谱系特异性的鉴定,拓宽了人们对肺脏细胞组成及其互作的理解。Wang等［17］利用scRNA-seq技术,确定出生后Ⅰ型肺泡上皮细胞(alveolar typeⅠ,AT1)的发育特点。发现成体AT1细胞群中同时含有Hopx+Igfbp2+和Hopx+Igfbp2-2个AT1细胞亚群,且其中Igfbp2+的AT1细胞比例在肺泡形成和肺切除后新形成的肺泡中增加,其在肺脏稳态及肺通气功能中的作用有待进一步揭示。

3 单细胞分析在呼吸系统疾病研究中的应用

3.1 单细胞分析与肺癌 肺癌的异质性被认为是设计和选择个体化治疗策略,以及重新定义肿瘤病理学分子类别的关键 线 索,并 用 于 精 准 医 学 治 疗［18］。Kim 等［19］应 用scRNA-Seq检测单个肿瘤内的基因表达和单核苷酸突变的全面信息,并从肺腺癌患者的异种移植物中分离出34个来源于患者的异种移植物肿瘤细胞,在这些细胞中鉴定出一个与抗癌药物耐药相关的候选肿瘤细胞亚群,有助于优化临床抗肿瘤策略。然而,人们更多关注的是,癌细胞的基因序列是否会在体内生长过程或体外培养过程中发生改变［20］。患者个体差异、原发或转移、癌变部位以及治疗方法等因素带来的肿瘤细胞微环境的异质性也会影响单细胞内基因表达的动态变化［21］。另外,靶向或非靶向药物本身也可直接或间接改变微环境发挥药理学作用,而微环境改变导致体细胞基因突变以及细胞对治疗的敏感性改变,这也是在治疗过程中产生耐药性的潜在机制之一。Suzuki等［22］通过构建和筛选scRNA-Seq文库,测量了肺腺癌细胞系中每个细胞对分子靶向药物反应的转录组特征,以及原始细胞和细胞获得耐药性后的差异。Guo等［23］通过单细胞转录组测序,检测了14例非小细胞肺癌患者在进行药物治疗之前,其外周血、癌旁组织和癌组织中的T 细胞,描述了在不同T 细胞亚群中一些已知的免疫治疗靶点基因的表达分布,揭示了不同的免疫治疗药物可能对应的靶向细胞,为非小细胞肺癌患者未来的精准治疗提供了支持。

3.2 单细胞分析与肺纤维化 气道重塑、炎症、肺泡破坏和蜂窝状肺被认为是肺纤维化的重要特征之一,肺纤维化是慢性肺疾病中病死率和发病率较高的疾病之一［24］。上皮修复是肺损伤后愈合的一个持续过程,在此过程中,上皮细胞迁移至损伤部位,分泌细胞因子促进自我增殖和分化,产生新的上皮细胞类型［4］。Xu等［25］通过scRNA-Seq分析基因表达的差异,定义了特发性肺纤维化动物模型中不同的上皮细胞类型,并追踪了慢性肺损伤修复过程中气道上皮细胞增殖分化的过程。scRNA-Seq分析可以确定许多与细胞亚型特异性相关或与疾病特异性相关的上皮细胞标志物,但由于临床活检、伦理以及技术障碍的限制,测量慢性肺疾病患者的单个上皮细胞分布是一个实际的挑战［19］。3.3 单细胞分析与哮喘 人类的肺脏能够与外界进行有效的气体交换,同时也通过黏膜免疫来抵御病原体的入侵而发挥屏障作用。肺内稳态依赖于结构细胞和免疫细胞之间密切的相互作用［26］。Vieira Braga等［27］收集并检测来自健康人以及哮喘患者的肺脏细胞,包括上呼吸道和下呼吸道细胞以及肺实质部位的细胞。研究人员在健康者中发现了肺部记忆性T 细胞,并在哮喘患者的肺部发现了新的黏液纤毛细胞和杯状细胞,这些细胞似乎有助于下呼吸道增生。除此之外,还发现了上皮内肥大细胞、致病性2型辅助性T 细胞。通常来说,各种细胞应该密切联系,以保持呼吸道的正常功能,但对于哮喘患者来说,这种细胞间的相互作用几乎不存在,而由炎性细胞取代。

4 单细胞研究的局限性

虽然目前单细胞测序技术在基础研究和临床研究中都得到了广泛的应用,但仍存在一些困难需要克服。最明显的困难之一就是需要将组织样本制成单细胞悬液。对于液体活检来说,如支气管肺泡灌洗液或外周血,制成单细胞悬液通常只需要原始活检样本的浓缩;而对于实体组织检查来说,从细胞外间质组织相互连接的细胞中分离出单个细胞的过程便更加困难,酶消化和机械消化的步骤是必不可少的,需要精确的方案和原始组织来源［28］。另外,在分离过程中,某些操作可能会给细胞带来影响,这些影响包括改变细胞的转录、表达以及代谢过程。因此,需要建立合适的单细胞制备技术,从而反映细胞体内的真实情况。

5 单细胞分析技术在呼吸系统疾病研究中的应用前景

生物个体中,不同组织器官中、同一组织器官中处于不同周期阶段的细胞都必须协同而又有差别地程序性开启或关闭某些基因,以便执行正确的生物学功能。在临床医学中,从微观水平上,观察单个细胞的动态变化,以及避开细胞的异质性,区分病变组织中正常细胞和病态细胞的生理状态,全面揭示病理学的改变,甚至发现一些新出现的丰度低的功能细胞,这些对于疾病的诊断和治疗都非常重要。单细胞分析技术为回答这些重要的问题提供了有效的分析技术与方法,未来还可以利用单细胞技术发现更多新类型的细胞,深入了解疾病的发病机制,甚至鉴别出在癌症或者疾病早期起关键作用的细胞及标志物,以这些标志物为指导进行疾病的预防、诊断,并可以根据此来研究新的治疗方式和药物。

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