结核分枝杆菌相关毒力因子研究进展

陈晓林 舒磊 冯旰珠

1南京医科大学附属逸夫医院呼吸内科211166;2南京医科大学第二临床医学院呼吸内科210011

由结核分枝杆菌 (Mycobacterium tuberculosis,Mtb)引起的结核病是全球十大 “致死性疾病”之一。研究表明,Mtb属胞内寄生菌,其感染、致病及预后等在很大程度上取决于宿主免疫与病原体之间的相互作用的结果[1],巨噬细胞则是该过程中的关键免疫效应细胞。Mtb感染肺组织时主要由巨噬细胞摄取,且其致病的关键过程均发生在巨噬细胞内环境中,被活化的巨噬细胞产生活性氧、活性氮中间产物,使之与吞噬体融合,从而发挥抗菌作用。然而,在长期的演化进程中,Mtb已经进化出包括产生毒力因子等在内的有效的方法来抵御这些宿主免疫细胞的杀灭效应。

与其他一些细菌病原体产生特定的毒力因子不同,Mtb是通过毒力相关因子和宿主防御反应的复杂免疫过程导致病理损伤,因此对Mtb毒力的深入研究有助于了解涉及结核病发病的不同阶段的相关因子。早在2003年人们通过鉴定194种Mtb基因,首次粗略评估了Mtb毒力因子的全基因组[2]。通过转座子定点杂交技术对小鼠感染模型研究显示:有126个基因是Mtb与宿主巨噬细胞作用过程中必需的[3]。新近研究推断可能有超过400种其他基因在Mtb与宿主巨噬细胞作用过程中是必需的[4]。这些研究结果为Mtb的毒力基因的定义提供了初步框架,其中许多基因是参与Mtb本身编码基础代谢的毒力蛋白,但更多单个基因在致病过程中的确切作用尚待研究。目前有关MtbESX/Ⅶ型分泌系统产生的分子及细胞膜的几种类型的复合脂质组分与宿主免疫系统相互作用的关系研究相对较为集中,本文拟就该领域的相关研究进展进行综述。

1 Ⅶ型分泌系统

致病菌可将毒力因子分泌到胞外或定位于细菌表面存在Ⅰ～Ⅶ型分泌系统。研究表明,Mtb的培养滤液中缺少经典的信号蛋白序列,但存在新的蛋白分泌系统,该系统被命名为ESX/T7SS分泌系统,即Ⅶ型分泌系统。

1.1 ESX-1分泌系统Mtb基因组编码5种Ⅶ型分泌系统(ESX-1～ESX-5),专门用于跨细胞膜运输选定的蛋白质底物[5]。编码分泌机制的核心组分 (ESX保守组分,Ecc)的基因在5个基因座中均为保守,其中ESX-4具有编码最简单和最早的Ⅶ型分泌系统的最小基因组。ESX-1被认为是发病机制中最重要的分泌系统之一。通过对Mtb、卡介苗(bacillus Calmette-Guérin,BCG)、自然减毒株田鼠分枝杆菌的基因组比较研究发现:构建BCG和田鼠分枝杆菌的RD1区的敲入株,均能编码分泌蛋白早期分泌抗原靶6 000蛋白(early secretary antigentic target 6kDa protein,ESAT-6)和培养滤液蛋白10,其长期以来均被认为是有效的T细胞抗原。而通过构建MtbH37Rv的RD1缺失突变株也证实了其分泌的抗原ESAT-6和培养滤液蛋白10是Mtb毒力所必需的。

Mtb作为一种胞内病原体,当其被巨噬细胞吞噬后,可通过干扰或延迟吞噬体向吞噬溶酶体的分化,或通过控制吞噬体酸化作用,促使吞噬体膜的破裂[6],从而避免了水解酶在宿主酸性环境下对Mtb的活性氧和活性氮的杀灭作用,该过程被认为是Mtb的免疫逃避策略。吞噬体破裂可反复地与ESX-1相关联,而MtbESX-1缺陷菌株及BCG都没有这种作用,即不能引起吞噬体破裂,提示ESX-1在抵抗Mtb宿主巨噬细胞的免疫过程中发挥了重要作用。利用对细菌表面β-内酰胺酶活性敏感的荧光探针和荧光共振能量转移的研究发现,在感染的后期阶段,Mtb可将胞内组分转运到巨噬细胞细胞质中,表明Mtb感染后能与宿主巨噬细胞存在联系[6]。最重要的是,由于BCG菌株中的RD1区缺失,导致吞噬体破裂不能完成,从而导致随后的免疫逃避信号传导中断,限制了疫苗的保护功效。因此,开发更有效的疫苗株的方法之一是设计具有功能性ESX-1系统的重组BCG菌株。尽管包含有RD1区域的BCG菌株确实提高了毒力作用,存在安全风险,但作为替代方案,制备具有生物安全水平2级的ESX-1基因座的BCG菌株[7],能提高其在小鼠感染模型中的保护效力,同时与功能性ESX-1系统的重组BCG菌株相比,毒力显著降低。当用亲本BCG菌株时,功能性吞噬体破裂诱导的几种宿主细胞免疫反应未出现。因为BCG中缺失分泌ESX1抗原的免疫原性,故应当与其他有助于保护性免疫加强的疫苗联合使用,例如减毒的Mtb疫苗MTBVAC[8],该疫苗作为活疫苗目前处于临床研发阶段[9]。

最近的研究发现:Mtb的RD7区Rv2346c基因编码的分泌蛋白为ESAT-6家族成员,与其他ESAT-6家族蛋白具有超过90%的同源性[9]。本课题组也发现:Rv2346c通过p38/miRNA/NF-κB信号通路抑制肿瘤坏死因子α和IL-6的产生,从而增强其在巨噬细胞内存活[10]。该基因可作为一个毒力因子促进肺组织的炎性损伤,增加小鼠的死亡率,为Mtb疫苗的研究策略提供了一个新思路。

1.2 ESX-5分泌系统 除了ESX-1分泌系统外,ESX-5也与分枝杆菌的致病力有关。ESX-5是最近进化的Ⅶ型分泌系统,只存在于生长缓慢的分枝杆菌中。ESX-5分泌系统最初是在海洋分枝杆菌中发现,其主要功能可能是分泌底物,这些底物主要属于PE和PPE蛋白的独特家族,分别以其N端Pro-Glu和Pro-Pro-Glu基序命名。这些蛋白家族约占MtbH37Rv基因组的8%,根据其C末端序列中存在的基序,进一步分为不同的亚组。PE的形成基于多拷贝的富含GC重复序列 (PE_PGRS),PPE的形成基于多态性串联重复序列 (PPE-MPTR),它们仅存在于致病物种中[11]。对Mtb的不同ESX-5突变体的研究显示:ESX-5系统的失活导致PPE蛋白输出缺陷、细胞壁完整性受损和强衰减[12]以及PE_PGRS输出的缺陷[13]。此外,ESX-5区域中编码PPE/PE基因的突变体:如MtbΔppe25-pe19显示衰减,但由于基因组中大量的PE/PPE同源体的表达,通过交叉反应性,仍能诱导强烈的CD4+T细胞免疫反应[14]。虽然Δppe25-pe19构建体衰减的分子机制目前尚不清楚,但对某些PE和PPE蛋白输出的干扰也与所选Mtb菌株的毒力增加有关。

通过对已经突变或丢失基因ppe38Mtb菌株的研究发现:PPE38是ESX-5介导的超过80个PE_PGRS和PPEMPTR底物分泌所必需的。该研究还发现:ppe38基因座通过IS6110介导的重组过程[15],在所谓的 “北京”家族的大多数Mtb菌株中缺失,因此提出了关于PE_PGRS和PPE-MPTR蛋白的毒力作用及其分泌机制中的重要性[16]。

1.3 ESX-3分泌系统ESX-3除了在铁和锌的获取中扮演重要作用外,研究发现ESX-3与Mtb毒性也有关[17]。它通过几种PE/PPE蛋白[18]及其分泌的底物EsxH和EsxG,抑制巨噬细胞和树突状细胞激活MtbCD4+T淋巴细胞特异性抗原,进而抑制吞噬体成熟[19]。

2 其他表面暴露因子

几十年来,分枝杆菌细胞包膜脂质结构的丰富性一直是人们研究的主题,Mtb细胞包膜具有复杂的组织结构,其常规质膜中包括一层肽聚糖与共价连接的多糖,又称为阿拉伯半乳聚糖,其五酰氨基末端被霉菌酸酯化。质膜中的这些成分含有60～90个碳原子的α-烷基-β-羟基脂肪酸,是分枝杆菌膜的特征结构,这对于分枝杆菌细胞的存活是必需的[20]。这些菌酸残基是分枝杆菌外膜内部小叶的主要成分,为一种独特的脂质双分子层;外部小叶由各种类型的非共价结合脂质组成,如海藻糖单霉菌酸酯、海藻糖二霉菌酸酯 (trehalose dimycolates,TDM)、结核菌醇二菌酸盐 (phthiocerol dimycocerosates,PDIM)、二乙酰海藻糖、聚乙酰海藻糖及硫脂质等等,其中一些由MmpL家族的分枝杆菌转运蛋白运输到外膜,从而构成药物开发的靶标[21]。

2.1 TDM 基于几十年积累的研究,分枝杆菌表面脂质和糖结合物是进入巨噬细胞、刺激各种受体的重要毒力因子。早在20世纪50年代,TDM已被证明是一种重要的效应分子,也被称为 “索状因子”,它被认为是显微镜下Mtb呈特征性索状外观的唯一因素。通过刺激巨噬细胞诱导的C型凝集素,TDM可导致细胞因子及NO的产生,同时,TDM可能是导致吞噬体延迟成熟的原因之一。TDM存在于所有分枝杆菌属的细菌的细胞壁,仅有菌酸残基存在微小的修饰变化。通过构建缺乏所有S-腺苷甲硫氨酸依赖性甲基转移酶的Mtb菌株及缺乏含氧功能基团的菌株的实验研究,菌酸修饰的免疫调节作用得到证实[22]。在小鼠感染模型中使用这些菌株的结果显示出严重的减毒和抗原特异性免疫应答的变化,这取决于特定修饰的存在。

2.2 Ham基因Ham基因对于含氧肌球蛋白 (含甲氧基的氧化霉菌酸酯)的合成是必需的。研究表明:氧化型分枝菌酸的形成依赖Ham基因,Ham基因的缺失不仅影响细胞壁的完整性,对特异性抑制IL-12p40介导的反应似乎也很重要。鉴于分枝菌酸生物合成的复杂性,脂肪酸合成酶在蛋白质与蛋白质相互作用中起关键作用[23]。Ham基因编码脂肪酸合成酶系统Ⅱ核心成分的基因突变,如kasB和hadC,均能影响分枝菌酸组成,从而影响各菌株的毒力[24],特别是氧化霉菌酸酯,对于形成泡沫状巨噬细胞至关重要,其分化感染的巨噬细胞富含脂滴,能够使细菌持久存在[25]。最近的研究阐明:这些分枝菌酸类的生物合成和代谢可以为研究它们对分枝杆菌的毒力和持久性的影响提供新线索[26]。

2.3 PhoP基因 先前关于硫脂质的毒力作用曾被提出质疑,然而最近研究发现:PhoP基因缺失或低表达菌株影响了硫脂质生物合成,提示硫脂质的产物与PhoP/R双组分调控系统相关联[27]。PhoP是双组分PhoP/R中的一个调节基因,PhoP敲除株在小鼠体内的毒力作用明显减弱[28]。MTBVAC是一种敲除phoP和fadD26(Rv2930)的弱毒Mtb候选疫苗,与BCG的安全性和生物分布相同,但保护性更强,是第1个进入临床评估的结核菌减毒活疫苗[29]。

2.4 PDIM PDIM可作为菌膜的组成部分,是结核杆菌细胞壁的主要脂类成分之一,仅存在于致病性分枝杆菌中,但也有人认为它们与宿主质膜的结合能够改变其生物物理特性,PDIM通过靶向宿主质膜脂质组织来控制巨噬细胞的侵袭,改变其生物物理特性,从而对吞噬细胞受体及其下游的信号通路起调控作用[30]。此外,研究表明PDIM对于ESX-1介导的有效吞噬体破裂是必不可少的,其机制尚待阐明[31]。

2.5 聚酮化合物合酶系统(polyketide synthase system,pks)最近研究证实:pks5基因敲除后,会导致细胞壁脂质成分LOS合成完全消失,而将pks5基因互补回突变株,其LOS合成完全恢复。LOS是分枝杆菌重要的脂质成分,对LOS功能的研究还不深入。有研究表明,纯化的LOS能够抑制巨噬细胞肿瘤坏死因子α的分泌,提示LOS可能类似于酚类糖脂,是分枝杆菌的毒力脂质[32]。

2.6 脂阿拉伯甘露聚糖(lipoarabinomannan,LAM)Mtb细胞包膜上的甘露糖化成分,如磷脂酰肌醇甘露糖苷、脂甘露聚糖和LAM,因其在宿主细胞识别中的重要性最近被广泛研究[33]。在体外,LAM结构的变化对免疫原性的影响引起了很多关注。LAM是Mtb慢生长的分枝杆菌细胞壁表面特有的脂糖,有研究报道,其末端的甘露糖加帽结构是Mtb的关键抑制性表位,介导免疫逃逸。它的核心骨架主要由3个结构组成,分别是阿拉伯聚糖和甘露聚糖形成的多糖主链、锚定物PIMs和末端帽子结构。致病物种特异性甘露糖帽基序导致的ManLAM主要起免疫逃逸作用,因为细胞质中钙离子浓度的升高是吞噬体成熟和与溶酶体融合所必需的,ManLAM可以抑制钙离子浓度的升高,从而抑制吞噬体的成熟和溶酶体融合。另外,不常见的甲硫基-D-木糖基序也证实存在于Mtb中,每分子ManLAM结合一个甘露糖帽,最近发现的负责其生物合成的遗传基因座将能够阐明其生物学作用[34]。牛分枝杆菌BCG和Mtb的突变株产生无帽LAM,而体内复制和细胞因子则无变化[35]。这种重要的糖缀合物的生物学功能尚需进行更深入的研究。前人在PIM寡糖、LAM阿拉伯寡糖及LAM类似物的合成,包括立体选择性地生成β连接的阿拉伯糖苷键等方面做了大量的工作,虽然这些工作为更加有效地制备LAM衍生物并将其应用于LAM的生物学研究,包括基于LAM的疫苗研发等提供了坚实的基础,但是到目前为止,仍然鲜有结核杆菌寡糖缀合物疫苗的研究报道或取得突破性进展。

2.7 CpnT CpnT是为数不多的特征性整合蛋白之一,是一种具有N末端外毒素结构域的通道形成蛋白,可导致Mtb诱导感染细胞坏死的能力[36]。CpnT似乎不会诱导大量的细胞因子产生,因此被认为允许“静息”的细胞免疫逃逸和导致结核杆菌感染的传播[37]。

2.8 Ag85复合物 几种独立于Ⅶ型分泌系统的重要的分泌蛋白也被描述为毒力因子。Ag85由Ag85A、Ag85B和Ag85C 3种组分组成,属于早期分泌蛋白,由Mtb的TAT分泌系统产生,在BCG中该蛋白复合体基因缺失。Ag85复合物在Mtb的细胞壁中起着非常重要的作用,Ag85复合物具有分枝菌酸转移酶的活性,可以使海藻糖转移和沉积在细胞壁上,在Mtb细胞壁合成晚期起重要作用。先前研究认为:这些抗原与疫苗接种有关[38]。但最近研究发现:产生免疫应答的Ag85蛋白表达水平受PhoP/R双组分调控系统的影响,使用Ag85作为免疫原不适用于保护所有Mtb菌株,因为可能存在免疫识别的菌株谱系依赖性变异[39]。在MVA85A疫苗与BCG比较的Ⅱb期临床试验中显示MVA85A疫苗无保护作用,认为Ag85A只产生了微弱的T细胞免疫应答。在MTBVAC疫苗中,Ag85B也可高度表达[40],细胞免疫反应强,研究表明Ag85B参与脂质的积累和储存,是Mtb潜伏期间所必需的一个重要抗原。

3 其他毒力因子

研究发现:Mtb毒力相关的转录因子可能参与PE/PPE基因的调控,主要包括Sigma因子、拟核相关的全局性转录因子Lsr2和EspR、双组分调控系统MprAB和PhoPR,这些转录调控因子之间可能存在相互作用,它们是直接还是间接参与PE/PPE基因的调控还有待于进一步研究。

另一个值得注意的例子是蛋白酪氨酸磷酸酶PtpA,它直接与空泡H+-ATPase结合,因此是吞噬体酸化的主要抑制剂之一[41]。然而,如前所述,分枝杆菌对吞噬体酸化和成熟的抑制相当复杂,比如通过SecA2介导的经典分泌途径输出的特异性蛋白质(SapM、PknG),均会影响含分枝杆菌的吞噬体的酸化和成熟[42]。

最后,强调一个名为moaA1-D1的基因簇。最近研究发现:由该基因簇编码的蛋白质可使结核杆菌能够利用硝酸盐作为呼吸链,从而在严重缺氧状态中得以存活,这一特征在宿主形成缺氧性肉芽肿显得特别重要[43]。特异性获得moaA1-D1簇的分子杆菌已被用作研究Mtb进化的生物模型[44]。

4 展望

总之,进一步研究了解Mtb的相关毒力因子,有助于明确Mtb在促进或限制宿主巨噬细胞感染的具体病理机制,进而影响疾病转归。结核病作为与宿主相关的疾病的特殊性以及某些Mtb菌株家族在全球人群中的的特异性,使得结核病的感染过程异常复杂。分子生物学技术的发展有助于发现更多的与Mtb致病相关的因子。因此,需要对Mtb病原体继续深入研究,以便更好地了解使Mtb成为强大且具有破坏性的病原体的进化适应过程,并寻找新的可能的解决方案,从而为抗结核药物及新型抗结核疫苗的研发提供关键的靶标。

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