经皮瘤内注射肾上腺素／顺铂对小鼠肝癌的抑制效果

江萍 王欣玥 王立峰 刘宝瑞 李茹恬

近年来，肝癌的发病率一直在增加，已成为第5 种 最常见的癌症类型（占癌症病人总数的54%），目前居癌症死亡原因的第2 位，5 年生存率为15%～17%［1-4］；手术是肝癌治疗的主要方式，但很多老年病人在确诊时已失去手术机会，仅10%～15%的病人可以接受手术治疗［5-8］。 在肝癌的治疗领域，靶向治疗药物和免疫卡控点治疗虽可改善预后，但新药往往价格昂贵，限制了其在晚期肝癌病人中的应用［9-10］；另一方面，由于肝癌血供丰富，肝癌的局部治疗一直是肝癌治疗的重要组成部分，应用也日益广泛，包括射频消融（adiofrequencyablation，RFA ） 、微波消融（microwave ablation，WMA） 、无水酒精注射治疗（percutaneous ethanol injection，PEI） 和冷冻消融（cryoablation），肝动脉栓塞化疗术（transarterial chemoembolization，TACE） ，外放射治疗（ external beam radiotherapy，EBRT） 和内放射治疗［11-12］；对不能切除的肝癌，采用超声或CT 引导下药物瘤体内注射［13］，具有操作简单， 不良反应少、损伤小及疗效好等特点。 但是，化疗药物有一定的不良反应， 不能无限量增加使用量，疗效不是很理想。 因此，提高肿瘤组织的化疗药物灌注量， 增加疗效， 减少化疗药物对周围正常组织的损害， 值得我们进一步研究。 铂类药物在过去的30 年广泛用于肝癌的治疗［14］，肾上腺素（Adr）已被证明可以增加肿瘤内顺铂（DDP）的浓度从而增加抗肿瘤作用［15］。 由于Adr 价格低廉，在临床上长期应用，被证明是安全可靠的，实用性强，性价比高。 本实验研究旨在证实Adr 和DDP在肝癌治疗上具有的协同效果。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物及瘤株：清洁级ICR（institute of cancer research）小鼠（n＝20），6～8 周龄，雌雄各半，体质量18～22 g，由南京大学医学院附属鼓楼医院实验动物中心提供；肝癌组织来源小鼠H22 肝癌细胞株，ICR 小鼠腹腔传代，由南京大学肿瘤研究中心提供。

1.1.2 主要试剂：Adr 由江西亿博药物有限公司提供；DDP 由山东铂源化学有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 建立鼠H22 细胞系动物模型：小鼠H22 肝癌细胞株，ICR 小鼠腹腔传代，无菌条件下抽取腹腔保种7～9 d 生长旺盛的H22 细胞，用生理盐水稀释成2×106／mL的细胞。 每只小鼠于左腋皮下接种瘤细胞悬液0.2 mL。 制备荷瘤ICR 鼠20 只，肿瘤接种完成后每2 d用卡尺测定肿瘤体积。 接种后7 d，肿瘤长径约6 mm 时，将小鼠随机分为4 组，每组5 只。 分组如下：对照组，Adr 组， DDP 组，Adr＋DDP 组。

1.2.2 给药方法：使用灭菌注射用水配制DDP 及Adr，瘤内注射。 对照组：灭菌注射用水0.2 mL／只；Adr 组：Adr 5 mg／kg，0.2 mL／只，瘤内注射；DDP 组：DDP 5 mg／kg，0.2 mL／只，瘤内注射；DDP ＋Adr 组：DDP 5 mg／kg＋Adr 5 mg／kg，0.2 mL／只，瘤内注射；所有小鼠均只注射1 次，观察15 d 后处死小鼠。

1.2.3 以脱颈椎法处死小鼠，完整剥离瘤组织，称重、测量体积后立即于福尔马林溶液中固定；取固定好的组织做石蜡切片，苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色。

1.3 观察指标

1.3.1 肿瘤体积：分组给药后隔日用游标卡尺测量肿瘤的长径a 及短径b，按公式：瘤体积（V）＝a × b2／2计算移植瘤体积，同时计算每组平均值，绘制移植瘤生长曲线。 计算抑瘤率（IR）＝ （1-治疗组体积／对照组体积） × 100%。

1.3.2 联合用药效应：评价两药合用在体内是否有协同作用，本文参照金氏公式［16］判断：Q＝E（a＋b）／（Ea＋Eb-Ea×Eb）。 其中E（a＋b）为两药合用的抑制率；Ea、Eb 分别为两药单用时各自的抑制率。 式中分子代表“实测合并效应”，分母代表“期望合并效应”。 Q ＜0.55 为明显拮抗（--），Q ＝0.55 ～0.85 为拮抗（-），Q＝0.85～1.15 为单纯相加（＋），Q ＝1.15 ～2.0 为增强（＋＋）。

1.4 统计学方法 采用SPSS 21.0 软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验或方差分析（F检验），以P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 对H22 肝癌移植瘤生长体积的影响 Adr 组的IR 为86.69%，与对照组比较差异具有统计学意义（P＜0.05）。 DDP 组的IR 为84.11%；Adr＋DDP 组IR 为93.26%，2 组对抑制肿瘤均有一定的增强作用，但差异无统计学意义（P＝0.060）；根据金式公式计算发现，Adr 与DDP 具有相加作用（Q ＝0.95），表明Adr 与DDP 联合用药后对DDP 抑制H22 肝癌的生长有增强作用。 见表1，表2。

2.2 移植瘤组织病理学观察

2.2.1 大体：移植瘤呈圆形、椭圆形或分叶状生长，质韧，切面灰白，大部分与周围组织分界清楚；

2.2.2 光镜：移植瘤细胞形状不规则，大小不均一，核大浓染，核异形性明显。 可见病理性核分裂象，核浆比例明显增大，可见组织坏死区；各组移植瘤组织病理切片HE 染色见图1。

表1 各组抑制H22 肝癌移植瘤生长作用的比较（±s，cm3，n＝5）

表1 各组抑制H22 肝癌移植瘤生长作用的比较（±s，cm3，n＝5）

时间 对照组 Adr 组 DDP 组 Adr＋DDP 组第1 天 0.12±0.01 0.12±0.04 0.10±0.02 0.14±0.07第3 天 0.27±0.13 0.08±0.04 0.16±0.09 0.12±0.03第5 天 0.48±0.31 0.13±0.04 0.21±0.09 0.12±0.04第7 天 1.17±1.03 0.19±0.06 0.35±0.29 0.18±0.02第9 天 1.73±1.48 0.20±0.19 0.70±0.86 0.19±0.11第11 天 3.36±1.76 0.44±0.48 0.73±0.70 0.22±0.12第13 天 4.98±2.08 1.01±1.37 0.70±0.72 0.53±0.27第15 天 6.59±2.56 0.88±0.99 1.05±1.07 0.44±0.16

表2 小鼠H22 肝癌移植瘤第15 天体积以及IR（±s，n＝5）

表2 小鼠H22 肝癌移植瘤第15 天体积以及IR（±s，n＝5）

注：与对照组比较，∗P＜0.05；与DDP 组比较，△P＜0.05

组别 体积（images/BZ_32_2127_335_2149_368.png±s， cm3） IR（%）对照组 6.59±2.56 -Adr 组 0.88±0.99∗ 84.11 DDP 组 1.05±1.07∗ 86.69 Adr＋DDP 0.44±0.16∗△ 93.26

图1 各组移植瘤组织病理切片HE 染色（×100）

3 讨论

在既往的研究中，α-肾上腺素能刺激引起肠血管系统的血管收缩并降低腹膜毛细血管密度，低剂量的Adr 诱导β2 受体介导的血管舒张，而较高剂量引起血管收缩。 Adr 诱导的血管收缩，使药物更深地渗透到肿瘤结节中，Adr 与DDP 联合使用，增加了DDP 在瘤内的浓度［17］，此外Adr 通过减慢通过肿瘤脉管系统的药物排出和降低间质压力来增加药物向肿瘤的扩散［18］、在我们的试验研究中，Adr 与常规化疗药物DDP 联用，IR 达到93.26%，与DDP 单药相比具有优势。 另外，实验结果提示单用Adr 对肿瘤生长也有抑制作用，IR 达到86.69%，移植瘤病理HE 染色病理切片提示，单用Adr，肿瘤组织内可见坏死灶，可能是肿瘤周围血管收缩，导致肿瘤组织血供减少，局部缺血坏死。

Adr 作为临床最常见的血管活性药物，其优势在于收缩血管的作用，而且价格低廉。 本研究着眼于“老药新用”，将常见的化疗药物DDP 与缩血管药物Adr 联合应用，可作为经过反复治疗不能耐受全身化疗的晚期老年肝癌病人以及无力支付高额靶向治疗或免疫治疗费用的晚期老年肝癌病人的替代选择，以期为经济条件相对较差的晚期老年肝癌病人带来一定的临床获益。 我们的研究结果表明，使用Adr 与化疗药物联合进行肿瘤的瘤内注射，可提高化疗药物的抗肿瘤效应，减少化疗药物对周围正常组织的损害， 降低对身体的不良反应，进一步提高其临床应用价值，值得进一步深入研究及临床应用探索。