两种基于细胞捕获的红豆杉抗肿瘤活性成分筛选方法的研究

薛 雪,朱龙平,杨得坡,赵志敏*

(1广东食品药品职业学院药学院药学教研室,广州 510520;2中山大学药学院生药与天然药化实验室;*通讯作者,E-mail:zhaozhm2@mail.sysu.edu.cn)

作为植物药中的典型抗肿瘤药物,红豆杉(Taxuschinensis(Pilger) Rehd.)在我国属于保护植物。紫杉醇的发现使红豆杉属植物开发研究活动广泛关注[1]。正是由于这个原因,红豆杉在中国是一个受保护的物种[2]。许多地区的都在进行红豆杉提取物的研究,但是除了紫杉醇外,其他的活性成分研究相对较少[3-5]。

如何快速筛选中药宝库中的活性成分,发现潜在的天然候选化合物,是中药新药开发的关键,也是阐明中药药效物质基础及质量控制的关键[6,7]。现代生物技术,如生物亲和色谱法[8],细胞膜色谱法[9,10],透析分离[11,12]被应用于中药生物活性成分的筛选。细胞膜色谱法(CMC)[13,14]的固定化细胞膜的寿命很短但是具有操作方便、快速稳定、灵敏度高等优点,尤其适用于中药等复杂体系的活性成分筛选。对于平衡透析方法是基于药物结合的平衡原理,主要是在测定药物游离浓度上有广泛的应用,在目前看来,此法仍是研究中药活性成分血浆蛋白结合率的常用方法[15]。上述方法存在一些不足之处,例如,将细胞膜从活细胞中分离,会使得细胞的生物学特征受到破坏从而影响筛选的准确性,活性筛选与色谱分离同时进行,所使用的条件无法满足二者的最佳条件。

本文采用的中空纤维细胞捕获结合高效液相色谱法(HFCF-HPLC)和细胞捕获-分散液相微萃取结合高效液相色谱法(CF-DLLME-HPLC),是在模拟生物自然吸收的情况下来筛选和捕获中药中的活性成分群。两种筛选方法采用逆向思维方式,HFCF-HPLC方法直接测定与细胞结合的成分为活性成分;CF-DLLME-HPLC方法根据细胞上清液成分的变化间接判断与细胞结合的活性成分。主要的影响条件得到了优化与研究。在HFCF-HPLC中,我们利用电镜对中空纤维细胞的内表面进行表征;通过比较与标准品的保留时间,确定了与细胞结合的化合物的结构。在CF-DLLME-HPLC,考察和优化影响CF-DLLME-HPLC的变量因素。结果表明,HFCF-HPLC和CF-DLLME-HPLC可以简单、快速地进行中药生物活性成分的筛选和分析。两种方法的成功应用为分析中药的生物活性提供新颖、有效和方便的方法,并且可以扩展使用到其他中药活性成分的筛选研究中。

1 材料

1.1 仪器与试剂

高效液相色谱设备(日本岛津公司LC-20A系统);低速离心机(上海安亭科学仪器厂);通用水套CO2培养箱(苏州净化设备有限公司);磁力搅拌器(江苏荣华仪器公司);倒置显微镜XD5-1B(德国Leica公司);旋转蒸发仪(EYELA,日本);SB25-12DTD超声波机器(宁波Scientz生物技术有限公司);聚醚砜纤维(PES,内径0.8 mm,孔隙大小0.2 μm)、聚砜纤维(PSF,内径0.8 mm,孔隙大小0.2 μm)、聚偏氟乙烯(PVDF,内径0.5 mm,孔隙大小0.2 μm)、聚丙烯纤维(PP,内径0.55 mm,孔隙大小0.18 μm),天津膜天膜生物科技有限公司;红豆杉,广州当地的商店;甲醇和乙腈,为色谱级试剂,购自天津大茂化学试剂厂;A549细胞株:中山大学药理实验室保存。

1.2 标准品和药材

脱乙酰巴卡亭、巴卡亭Ⅲ、紫杉碱M、去乙酰紫杉醇、三尖杉宁碱、紫杉醇、浆果赤霉素、金松双黄酮、云南紫杉烷:美国Sigma公司;红豆杉(Taxus chinensis)药材批号:20141121,广州市大参林药店昌岗分店。

红豆杉药材样品经过中山大学药学院生药与天然药物化学实验室杨得坡教授鉴定为红豆杉科(Taxaceae)红豆杉属TaxusL.南方红豆杉Taxuschinensisvar. mairei。

2 方法与结果

2.1 CF-DLLME-HPLC方法

2.1.1 操作步骤 将A546细胞在6孔培养板中培养,细胞接种密度5×105个/cm2。37 ℃培养箱,1640培养基培养24 h,更换无血清培养基,饥饿细胞6 h后,加入TCE(400 μg/ml)溶液分别培养不同时间(1,12,24 h)。

将6.0 ml含有中药提取液的细胞上清放入10 ml带盖玻璃的离心管中,利用500 μl注射器将含有400 μl四氢呋喃(分散剂溶剂)与60 μl CHCl3(萃取溶剂)的溶液迅速注入样品溶液中。注射后,可以看到均匀的混悬液状态,紧接着用手轻轻振摇。振摇2 min,静置5 min直到分析物在水溶液和萃取溶液中达到平衡。在3 000 r/min离心10 min。有机相即可沉入试管尖端底部。利用1 ml微量进样针将有机相缓慢吸出转移至2 ml样品瓶中,水浴蒸发有机溶剂,加入50 μl色谱级别甲醇溶解,取20 μl注入高效液相色谱分析。所有的实验操作平行进行3次。

红豆杉提取物色谱条件:Inertsil ODS-SP-C18柱(5 μm,250 mm×4.6 mm i.d. Agilent Technologies),检测波长227 nm,柱温37 ℃,进样量20 μl,流速0.8-1.0 ml/min,流动相:乙腈(A)-水(B),用0.45 μm微孔滤膜过滤。梯度洗脱:0-10 min,85% A;10-50 min,85%-4% A;50-55 min,4%-85% A。

2.1.2 萃取条件筛选 本实验考察了萃取剂种类、萃取剂体积、分散剂种类、分散剂体积对萃取效率的影响,结果见图1。

除上述筛选萃取条件优化外,本实验还考察了细胞接种密度(1×106,5×106,8×106和8×107)以及给药浓度(100-800 μg/ml)对筛选效果的影响,最终确定筛选条件:TCE浓度为400 μg/ml;细胞接种密度为5×106个;萃取剂为60 μl氯仿;分散剂为400 μl四氢呋喃。本实验利用9种标准品测定保留时间重现性,保留时间RSDs<0.97%,说明CF-DLLME-HPLC重现性良好,分析结果准确可靠。

2.1.3 应用及结果 本研究中脱乙酰巴卡亭、巴卡亭Ⅲ、紫杉碱M、去乙酰紫杉醇、三尖杉宁碱、紫杉醇、浆果赤霉素、金松双黄酮、云南紫杉烷被作为活性成分筛选的模型化合物,红豆杉作为中药的研究对象。

CF-DLLME-HPLC提取TCE与A549细胞孵育不同时间,细胞上清液成分变化如图2所示。潜在活性成分可以根据孵育前后化合物峰面积的变化而推测。如图2所示,培养时间从1 h延长到24 h,可以观察到活性成分显著变化,1 h孵育后,6-紫杉醇的含量逐渐降低并且趋于稳定,4-去乙酰紫杉醇、5-三尖杉宁碱、9-云南紫杉烷、X1的含量随培养时间增加逐渐降低,可推测为几种化合物由于跟细胞有结合所导致；3-紫杉碱M和8-金松双黄酮没有显著变化,可能是因为他们不被细胞吸收所导致。

1.脱乙酰巴卡亭;2.巴卡亭Ⅲ;3.紫杉碱M;4.去乙酰紫杉醇;5.三尖杉宁碱;6.紫杉醇;7.浆果赤霉素;8.金松双黄酮;9.云南紫杉烷图2 TCE与A549细胞作用24 h内的色谱图Figure 2 HPLC chromatograms of supernatants within 24 h after incubation of Taxus chinensis and A549 cells

2.2 HFCF-HPLC方法

2.2.1 操作步骤 将细胞悬液转移至细胞冻存管中,将细胞吹打均匀。用无针头的1 ml注射器轻轻将细胞悬吸入,用镊子辅助装上针头。用镊子夹取中空纤维平放于培养皿的上方,在中空纤维一边插入装有细胞悬液的注射器针头,将细胞悬液注入到中空纤维中,直至另一头溢出细胞悬液为止,将注满细胞悬液的中空纤维平放于培养皿中,向培养皿中加入5 ml培养液使得培养液没过中空纤维,之后放于培养箱中培养24 h 待用。

取红豆杉提取液(TCE)500 μl置于10 ml玻璃小瓶中,加入4.5 ml在37 ℃恒温处理的pH 7.4磷酸缓冲液,放入搅拌子并固定于磁力搅拌器上。将预先种植好A549细胞的聚丙烯中空纤维弯成U形,将两端用棉线封口,放入上述的中药提取液的小瓶中。在模拟人体环境下,匀速搅拌筛选3 h。筛选结束后将中空纤维从中药提取液中取出,剪掉两端封口处,将纤维管内液体打入2 ml EP管中,用20 μl的甲醇冲洗中空纤维内壁,并和EP管中溶液合并。10 000 r/min离心20 min。取上清液20 μl,在最佳的色谱条件下进行高效液相色谱分析,每次实验重复3次。同时进行空白对照试验(装有培养液中空纤维筛选)。

2.2.2 萃取条件筛选 中空纤维的选择：为了保证实验结果的可重现性与稳定性,方法必须首先排除中空纤维与TCE的活性成分存在非特异性结合作用。本实验考察了聚丙烯、聚偏氟乙烯、聚醚砜和聚砜中空纤维作为A549细胞的载体,筛选TCE中的活性成分群。实验结果发现,上述4种中空纤维均可作为A549细胞良好的载体,并在筛选过程中,没有出现中空纤维破损现象。本研究最终选择不含活性集团的聚丙烯中空纤维作为细胞载体进行活性筛选。

中空纤维的表征：利用扫描电子显微镜观察聚丙烯中空纤维种植细胞后的形态学特征。电镜空白对照中空纤维内表面图片(×1 800)显示,含有培养液的空白对照中空纤维内壁:毛孔均匀分布,干净,没有任何添加物(见图3A)。种植A549细胞后的中空纤维内壁(×3 000)显示:细胞生长状态良好,细胞饱满,分布均匀,在纤维孔径中健康生长(见图3B)。

A.空白对照中空纤维 (×1 800) B.种植A549细胞后中空纤维 (×3 000)图3 空白纤维与种植细胞纤维的内壁电镜图像Figure 3 SEM images of inwall of blank polypropylene fiber and polypropylene fiber planted with cells

除上述条件外,实验还对筛选时间、搅拌速度、筛选前后细胞活力大小以及方法的重现性做了验证,最终确定筛选时间:3 h;搅拌速度:600 r/min。利用台盼蓝染色法计算活细胞数目,筛选过程结束后,仍然有75%的细胞仍保持活力,从而确保筛选结果的可靠性。本实验利用9种标准品测定保留时间重现性,保留时间RSDs<0.91%,说明HFCF-HPLC重现性良好,分析结果准确可靠。

2.2.3 应用及结果 本研究中脱乙酰巴卡亭、巴卡亭Ⅲ、紫杉碱M、去乙酰紫杉醇、三尖杉宁碱、紫杉醇、浆果赤霉素、金松双黄酮、云南紫杉烷被作为活性成分筛选的模型化合物,红豆杉作为中药的研究对象。

HFCF-HPLC,红豆杉中的活性成分利用种植A549中空纤维细胞筛选进行,图4显示,筛选后色谱峰与空白筛选对照比较,峰的个数与峰面积均有显著增加,这个结果说明纤维内的细胞与药物存在结合作用,而在空白对照组中,中空纤维与培养液之间不存在结合作用或者结合作用较弱。从图4中可以看出,A549中空纤维筛选后有4个活性成分被成功筛选出来,与标准品保留时间比对,他们分别是脱乙酰巴卡亭、去乙酰紫杉醇、紫杉醇,未知的化合物N1、N2需要进一步通过质谱、红外等检测手段进行判定。

2.3 两种方法的筛选结果

利用两种筛选方法对红豆杉抗肿瘤活性成分群进行筛选,与标准品比对可以确定的有脱乙酰巴卡亭,去乙酰紫杉醇,三尖杉宁碱,紫杉醇,云南紫杉烷。两种筛选方法筛选出的活性成分具体参数见表1。

a.标准品;b.空白中空纤维筛选;c.A549细胞中空纤维筛选;1.脱乙酰巴卡亭;2.巴卡亭Ⅲ;3.紫杉碱M;4.去乙酰紫杉醇;5.三尖杉宁碱;6.紫杉醇;7.浆果赤霉素;8.金松双黄酮;9.云南紫杉烷图4 HFCF-HPLC筛选结果Figure 4 Chromatograms of the active components in Taxus chinensis

表1 两种方法活性筛选结果

Table 1 The screening results of active components in Taxus chinensis using two methods

方法峰号活性成分保留时间(min)ⅠⅡⅢ平均保留时间(min)RSD(%)(n=3)CF-DLLME-HPLC4去乙酰紫杉醇29.8329.8829.8529.850.095三尖杉宁碱32.5832.5632.5532.560.056紫杉醇33.7833.7633.7933.780.059云南紫杉烷40.6840.7140.6840.690.04X1未知47.6147.6547.6247.620.10HFCF-HPLC1脱乙酰巴卡亭20.3120.3520.3520.330.084去乙酰紫杉醇29.8529.8529.8329.840.046紫杉醇33.7533.7633.7833.760.04N1未知28.2528.2828.2428.260.06N2未知32.1432.1732.1632.160.04

3 讨论

HFCF-HPLC筛选化合物的个数以及峰面积一般都小于CF-DLLME。这可能归因于HFCF-HPLC过程,中空纤维在筛选过程中存在微孔过滤功能,可以排除中药杂质以及大分子物质的干扰;转子的搅拌可能会影响细胞在纤维内部上的代谢;模拟生物体内环境不能反映真实的体内微环境;细胞捕获时间很短(HFCF)导致细胞和药物只有结合过程而在CF-DLLME中却存在相关代谢发生。

CF-DLLME-HPLC法将液相微萃取技术应用到成分检测中,极大提高了方法灵敏度,可以筛选出有活性但含量低的活性成分,浓缩倍数的提高相应会提高方法的灵敏度;活性筛选和样品净化可以单独执行,提高检测的准确性;用完整的细胞作为筛选模型,保持了细胞完整、特有的生物结构和特性,确保了筛选结果的可靠性。HFCF-HPLC法将活细胞种植于纤维内壁,保持了细胞特有的生物结构和特性;中空纤维作为细胞的载体,同时也起到了对提取液净化过滤的作用目的,使得筛选结果更加清晰;操作简单省事,时间周期短,节约细胞用量,筛选成本低。两种方法的成功应用为中药活性成分的筛选和中药多成分、多靶点、协同性和整体性作用特性的研究提供一种方便、普适和高效的新思路。