高压氧对老年脑缺血大鼠血清心型脂肪酸结合蛋白含量的影响及机制

郭知伟 陈玉军 王宝庆 张金浩 姜建强

(齐齐哈尔医学院附属第一医院神经外科，黑龙江 齐齐哈尔 161000)

多源性小细胞是脂肪酸结合蛋白(FABP)的主要组成成分，脑部组织中主要包括心型FABP(hFABP)及脑型FABP两种，在脑梗死等严重的心血管疾病发生的过程中常常伴随神经细胞的损伤甚至死亡，细胞内hFABP释放入血引起血清中含量升高。研究表明，在缺血后再灌注的发生过程中常常伴随结合蛋白含量的改变〔1〕，本文探究缺血再灌注过程损伤与蛋白含量改变之间的相关性，分析高压氧(HBO)对老年脑缺血大鼠血清hFABP含量的影响及机制。

1 资料与方法

1.1一般资料 购自上海实验动物有限公司的老年大鼠180只，纳入标准：(1)均统一采购，经专门企业培养；(2)生活环境及饮食条件完全相同。排除标准：(1)体重严重偏离平均体重；(2)伴有病菌感染等疾病〔2〕。随机分为研究组和对照组，研究组90只，其中雌性45只，雄性45只，月龄19～21个月，平均月龄(20.5±0.2)个月；对照组90只，雌性43只，雄性47只，月龄19～22个月，平均月龄(20.7±0.3)个月，两组一般资料差异不存在统计学意义(P>0.05)。

1.2血清hFABP含量检测 分别于两组大鼠接受HBO治疗前后抽取其空腹血液，样本抽取结束保存在加有抗凝剂的无菌管中，血量为5 ml，随后在1 500 r/min的条件下进行离心并将血清保存于-80℃的条件下备用，应用hFABP试剂盒(上海恒远有限公司)进行双抗体夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)，操作过程严格按照说明书进行〔3〕。

1.3脑组织小窝蛋白-2及基质金属蛋白酶(MMP)-2检测 测定均通过免疫印迹法，具体为：首先对大鼠进行深度麻醉，用低温下的磷酸盐缓冲液(PBS)进行心脏灌流，随后选取缺血再灌注段的脑组织微血管并采用裂解液制作匀浆，随后在4℃、转速为15 000 r/min的条件离心并对上清液进行蛋白测定，蛋白测定的方法为考马斯亮蓝G-250结合定量法〔4〕。具体操作为在体积分数为10%的聚丙烯酰胺凝胶电泳中分离不同分子质量及电荷量的蛋白质，随后将不同条带转移至分别含有脑组织小窝蛋白-2及MMP-2抗体的硝酸纤维素薄膜上孵育过夜，在计算机软件下进行蛋白分离结果的扫描，根据条带的光密度值测定其含量〔5〕。

1.4血脑屏障(BBB)通透性检测 通过伊文思兰测定脑组织，具体操作严格按照说明书进行〔6〕。

1.5再灌注模型建立 再灌注模型的建立方法为大脑中动脉线栓法，具体为：使用10%的水合氯醛进行腹腔注射以麻醉大鼠〔7〕。麻醉成功后切开其左侧颈部使颈总动脉充分暴露，最后使用剥离分针分离此处的迷走神经，分离结束后进行翼腭动脉及颈外动脉的结扎，随后借助末端较为圆润的尼龙丝分别经过颈外动脉及颈内动脉置入大脑前部的交通动脉内，插入深度为120～200 cm，具体的深度根据大鼠的体重及头部体积等具体调整，插入后即达到阻塞大脑动脉右侧血液供应的目的，堵塞时间为2 h左右，拔出尼龙线即完成再灌注模型的建立〔8〕。

1.6脑梗死体积测定 大鼠接受HBO治疗后采用颈部折断法处死并采集脑组织，随后制成厚度为2 mm左右的切片〔9〕。将切片置于1.2%的氯化三苯基四氮唑磷酸盐缓冲液中，在37℃的条件下恒温保存30 min，分别置于蓝色背景中进行拍照并利用HPIAS-1000图像分析系统测量计算梗死体积百分比〔10〕。

1.7再灌注过程死亡率及脑组织损伤率发生 脑组织损伤率通过梗死体积的变化进行衡量，损伤率=脑梗死面积增大只数/总只数〔11，12〕。

1.8统计学方法 采用SPSS18.0软件进行t检验及χ2检验。

2 结 果

2.1两组治疗前后血清hFABP含量比较 治疗后研究组血清hFABP含量明显高于对照组(P<0.05)，见表1。

表1 两组治疗前后血清hFABP含量对比

与治疗前比较：1)P<0.05，表2、表3同

2.2两组脑组织小窝蛋白-2及MMP-2表达对比 治疗后研究组脑组织小窝蛋白-2、MMP-2表达明显高于对照组(P<0.05)，见表2和图1。

表2 两组相关蛋白表达对比

1.对照组治疗前；2.研究组治疗前；3.对照组治疗后；4.研究组治疗后图1 治疗前后两组脑组织小窝蛋白-2、MMP-2表达

2.3两组BBB通透率对比 治疗后研究组BBB通透率明显小于对照组(P<0.05)，见表3。

表3 两组BBB通透率对比

2.4再灌注过程中两组死亡率对比 研究组再灌注死亡率〔13只(14.4%)〕明显小于对照组〔21只(23.3%)，χ2=4.892,P<0.05〕。

2.5再灌注过程两组脑组织损伤率对比 研究组脑组织损伤率明显低于对照组(P<0.05)，见表4。

表4 再灌注过程中两组脑组织损伤率对比〔n(%),n=90〕

3 讨 论

疾病的早发现早治疗能够明显优化患者的疾病治疗效果，提高生存率〔13〕。对于脑梗死等恶性疾病可以通过血管的疏通协调全身的血液流动状况，但是在抢救过程中的再灌注损伤率使疾病的治疗效果大大下降，因此做好疾病治疗的监控工作，可有效避免再灌注给患者生命健康带来的威胁〔14〕。本研究结果说明HBO治疗能够通过减少患者的脑梗死面积，提高机体血液的流通程度优化疾病治疗效果。

研究表明，HBO能够大大降低BBB通透性，进一步引起脑部血流量的下降，减少脑组织内对于水分的吸收，防止脑部组织在高渗环境下出现脑水肿〔15〕。本研究结果说明HBO进行再灌注过程中的机制是改变BBB之间的通透性，维持正常的渗透压平衡。毛细血管内皮细胞、基膜及星形胶质细胞的突触是BBB的主要组成成分，是中枢神经系统与外界环境之间的重要屏障。BBB的功能下降甚至丧失是脑缺血再灌注损伤发生时的主要病理学基础，经典的跨膜转运是细胞质膜微囊介导的主要途径，脑组织蛋白也是脑内参与物质及信息传递的重要物质，参与多类心血管疾病的发生过程〔16〕。

hFABP属于脂肪酸家族的成员之一，是FABP3 基因的重要表达产物，心肌细胞是其主要分布的部位，在细胞质中所占的比重为10%左右，是脂肪酸转运过程的重要参与者，机体任何组织出现缺血损伤后会伴随此类蛋白血清含量的异常升高。本研究结果说明，应用HBO进行辅助治疗能够明显改善组织及细胞的供氧能力，最大程度减少细胞凋亡的发生概率，改善血清hFABP水平。MMP-2广泛分布于机体的各类细胞和组织中，其含量与患者缺血时间之间存在较大的相关性，研究表明正常脑组织中此类蛋白表达量极低甚至无表达〔17〕。本研究结果说明，HBO能够通过改善机体MMP-9含量及活性减少再灌注过程中的损伤。

综上，在大鼠脑缺血再灌注过程中会伴随体内hFABP含量升高，但在再灌注过程中辅助HBO治疗能够明显减少再灌注过程中的损伤，降低死亡率，利于临床上的再灌注诊断及再灌注损伤情况的监控，通过动物模型的建立能够为临床心血管疾病的诊断及监控治疗提供建设性建议，可行性较高。