p16和Ki67在宫颈癌癌前病变及宫颈癌中表达及其与HPV感染的相关性

何旻 谢南子 陈观美 程其会 宋红梅

(安顺市人民医院，贵州 安顺 561000)

子宫颈癌是妇科常见的恶性肿瘤疾病，在全部女性恶性肿瘤疾病中发病率仅次于乳腺癌，居第二位〔1〕。高危人乳头瘤状病毒(HPV)持续感染被认为与宫颈癌发生、发展相关，宫颈在受到HPV持续感染后，可以通过与之相关的基因产物干扰正常细胞周期的调节，进而引起细胞连续增殖及恶性转化〔2,3〕。目前，细胞学筛查与HPV检测是我国宫颈癌主要的筛查手段，但二者均受主观、客观等因素影响，特异性较低，应用受到限制〔4〕。故积极找到一种与宫颈病变程度、HPV感染情况相关的客观指标极为必要。p16是细胞周期依赖性激酶抑制蛋白，是一种新型抑癌基因，能够直接对细胞周期的紊乱产生抑制，介导细胞的无限制增生，甚至是癌变，被用于诸多恶性肿瘤细胞增殖、转移的评估中〔5,6〕。Ki67是增殖性细胞合抗原，仅在细胞增殖周期的G1、G2、S、M期有表达，而在G0期表达缺失，也被用于诸如肺腺癌等恶性肿瘤预后评估中〔7〕。若同一组织中同时存在p16与Ki67表达则提示高级别病变可能，该机制为区分潜在高级别宫颈病变提供了客观性依据，但目前将二者用于宫颈病变筛查的相关研究并不多见。本研究主要观察老年宫颈癌前病变及宫颈癌患者p16、Ki67表达及HPV感染情况，分析p16、Ki67与HPV感染的相关性，旨在找到能够区分潜在高级别宫颈病变的客观性指标，以指导临床。

1 资料与方法

1.1一般资料 回顾性收集并分析安顺市人民医院2017年3月至2019年3月经刮诊或手术病理证实的宫颈癌前病变老年患者100例作为宫颈癌前病变组，同期经刮诊或手术病理证实的宫颈癌老年患者60例作为宫颈癌组，同期在院接受治疗的宫颈炎患者60例作为宫颈炎组。宫颈癌前病变组年龄60～85〔平均(73.24±5.21)〕岁；体重44～78〔平均(60.24±11.21)〕kg。宫颈癌组年龄60～84〔平均(72.69±5.19)〕岁；体重45～78〔平均(61.04±11.17)〕kg。宫颈炎组年龄60～85〔平均(73.36±5.32)〕岁；体重45～79〔平均(61.78±12.01)〕kg。3组一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)，有可比性。

1.2入选标准 (1)纳入标准：①临床资料完整者；②宫颈癌前病变及宫颈癌组均经宫颈刮诊或手术病理确诊；③既往均无宫颈物理治疗史及手术治疗史；④年龄≥60岁；⑤宫颈炎患者经查无恶性病变，为单纯的宫颈炎。(2)排除标准：①既往接受宫颈物理治疗或手术治疗者；②既往接受化疗、放射治疗者；③合并其他恶性肿瘤疾病者；④合并其他心、肝、肾等重要脏器衰竭或不全者；⑤合并其他可能对p16、Ki67等检查结果有影响的疾病者。

1.3方法 全部入组者均采用免疫组织化学染色法测定其p16、Ki67表达，同时给予宫颈刮诊实施TCT检查，以判断HPV感染情况。

1.3.1免疫组织化学染色法 免疫组织化学染色法试剂盒由福州迈新公司提供，参照试剂盒具体说明书进行操作〔8〕。二氨基联苯胺(DAB)显色，石蜡切片后脱蜡水化，后经微波抗原修复，使用过氧化酶阻断剂对内源性过氧化物酶活性灭活后，采用羊血清工作液封闭，并向内滴加一抗，置于4℃的条件下过夜，向内滴加经过生物素标记的二抗，同时向内滴加过氧化物酶溶液，经DAB显色后使用苏木素复染，将已经明确阳性的组织切片作为阳性对照，使用磷酸盐缓冲液(PBS)替代一抗用作阴性对照。结果判读：p16阳性表达于细胞质或细胞核上，以出现棕黄色或黄色颗粒为阳性。Ki67阳性表达于细胞核上，以棕黄色颗粒为阳性。阳性细胞数与技术细胞总数之比为阳性百分率。P16阳性细胞数低于5%则判定为阴性，细胞数5%～25%定义为弱阳性(+)，细胞数26%～75%则定义为中等阳性()，细胞数>75%则定义为强阳性。Ki67阳性表达在上皮基底层定义为阴性(-)，表达超出基底层的10%～25%定义为弱阳性(+)，表达超出基底层的26%～75%定义为中等阳性()，表达超出极低层超过75%为强阳性()。

1.3.2宫颈学细胞检测 使用一次性宫颈细胞采样刷，指导患者仰卧于检查床上，将检查刷置于子宫颈内，取病灶部位少量标本，在保存液内将收集来的病变组织仔细清洗，并制片，由具有丰富阅片经验的专业细胞学医师进行阅片，参照子宫颈细胞学TBS标准进行阅片并判定其感染情况〔9〕。

1.4统计学方法 应用SPSS20.0软件进行χ2检验，相关性分析采用Spearman相关性检验。

2 结 果

2.13组p16、Ki67蛋白阳性率比较 3组中，宫颈炎组p16、Ki67蛋白阳性率最低，其次为宫颈癌前病变组，宫颈癌组患者阳性率最高，组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 3组p16、Ki67蛋白阳性率比较〔n(%)〕

与宫颈炎组比较:1)P<0.05；与宫颈癌前病变组比较:2)P<0.05

2.23组HPV感染率比较 3组中，宫颈炎组HPV感染率最低〔15.00%(9/60)〕，其次为宫颈癌前病变组〔90.00(90/100)〕，宫颈癌组感染率最高〔100.00%(100/100)〕，组间比较差异有统计学意义(χ2=136.913,P<0.001)。

2.3p16、Ki67表达与宫颈癌前病变/宫颈癌患者HPV感染相关性 p16、Ki67与宫颈癌前病变患者及宫颈癌患者HPV感染均呈正相关(r=0.744，0.561，均P<0.001)。

3 讨 论

在我国多数地区及基层医院宫颈癌的筛查手段仍以细胞学检测为主，但多年的实践研究发现，细胞学检测存在准确性差、灵敏度低下、特异度低下、质量控制不佳等诸多问题〔10〕。为了提高各偏远地区及基层医院宫颈癌前病变的筛查与诊断率，需尽快找到一种合理且准确的筛查技术。就现有的研究来看，生物学指标用于宫颈癌前病变与宫颈癌的诊断具有重要的应用价值〔11〕。相较于细胞学诊断，分子生物学标志物的应用，诸如p16、Ki67等，其采用的免疫组织化学染色技术的结果判定并非完全依赖细胞形态学，相对而言，其对医生的技术要求更为简单，只需对医生进行必要的阅片培训便可判定〔12〕。

本研究主要对p16、Ki67两种生物学标志物用于宫颈癌前病变及宫颈癌HPV感染预测的价值进行观察分析。p16对应的p16iKN4A基因位于第9号染色体短臂第2区1带，是最近几年发现的继p53基因后又一个重要的抑制基因，属于INK4A家族成员之一，是cyclin-CDK复合物特异性抑制剂，可直接作为细胞周期调控分子开关，几乎是全部恶性肿瘤常见的分子事件〔13〕。此外，p16还是近几年研究出的第一个可直接对细胞增殖周期进行调控的抑癌基因〔14〕。在正常的上皮内p16表达极弱甚至不表达，但在肿瘤组织内p16表达则明显增强。本研究显示，随着宫颈病变级别、恶性程度增加，p16表达强度也随之升高，这与刘峰等〔15〕研究结果相符。经上述结果可以推测，在宫颈上皮癌前病变向癌发展期间p16高表达可能起到关键的促进作用。

Ki67是细胞增生相关蛋白的一种，可能参与了细胞周期蛋白的调控，与细胞周期蛋白联系密切，至今临床一直未停止对Ki67蛋白的机制及具体功能进行研究，然而针对该蛋白的具体机制及主要功能仍未完全明确，但现有的研究已经证实，该蛋白可以用在日常病理工作实施中，可作为肿瘤细胞主要的增殖标志物〔16〕。Ki67属于增殖细胞核抗原，因其半衰期短，且阳性表达几乎覆盖了整个有丝分裂周期，故能够很直观地反映出细胞增殖活性〔17〕。Ki67蛋白在正常上皮内无表达，只有当上皮出现病变或发生肿瘤疾病时，其表达才会增强，且随着病变程度与恶性程度呈逐渐增强的趋势。本研究结果显示，Ki67可能参与了宫颈癌前病变、宫颈癌等疾病的发生与发展过程中。

HPV持续感染是被首先提出的一个宫颈癌病因假说，随着研究的深入，国内外医学专家对HPV结构、生物学特性、功能及致癌机制等均展开了大量的研究，从基因水平及分子学方面对其与宫颈癌之间存在的关系进行深入研究认为，HPV是引起宫颈癌发生发展的独立危险因素〔18〕。HPV感染检测是早期筛查并发现宫颈癌前病变与宫颈癌的有效手段，可见若要进一步分析各生物学标志物与宫颈癌的相关性，可首先分析各生物学标志物表达与患者HPV感染的相关性，来间接评价其与宫颈癌的关系。本研究结果显示，宫颈癌前病变与宫颈癌患者p16、Ki67蛋白呈高表达，且与患者HPV感染明显相关，随着p16、Ki67蛋白表达升高，患者感染HPV风险增加，未来可考虑将p16、Ki67蛋白的动态监测结果作为宫颈癌前病变及宫颈癌早期筛查与诊断的主要生物学标志。