晚期非小细胞肺癌外周血循环肿瘤细胞的检测及临床意义

苟小丽 苑成 柏玉举 石磊 邢时云 马虎

(1遵义医科大学附属医院，贵州 遵义 563000；2遵义医科大学第三附属医院 遵义市第一人民医院)

肺癌是我国目前发病率和死亡率均居高不下的恶性肿瘤，近年来相关调查显示，肺癌是发病率和死亡率均排名第一的恶性肿瘤，严重威胁人们身体健康〔1〕。肿瘤的复发和转移是导致晚期肺癌患者死亡的重要原因〔2〕。恶性肿瘤难以被治愈的重要原因在于肿瘤微转移灶难以被彻底清除，造成肿瘤的复发和转移。血行播散是肿瘤细胞主要的转移途径之一。循环肿瘤细胞是进入外周血液循环中的肿瘤细胞，与恶性肿瘤血行播散的发生密切相关〔3〕。目前临床已经逐步开始将循环肿瘤细胞测定应用于肿瘤的早期诊断中〔4〕。本研究探讨晚期非小细胞肺癌循环肿瘤细胞的测定及其意义。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2017年1月到2018年12月晚期非小细胞肺癌患者38例为病例组，男22例，女16例，年龄42～73〔平均(64.61±7.13)〕岁，ⅢA期5例，ⅢB期13例，Ⅳ期20例。选取同期收治的肺部良性病变患者30例为对照组，男16例，女14例，年龄38～72〔平均(59.77±8.04)〕岁，17例为肺部感染，7例为支气管哮喘，5例为慢性阻塞性肺疾病，1例为慢性支气管炎。两组性别、年龄比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2纳入和排除标准 参照《中国晚期原发性肺癌诊治专家共识(2016年版)》〔5〕进行诊断。病例组均根据临床症状、肺部CT及磁共振成像(MRI)检查，并经病理检查，确定诊断为晚期非小细胞肺癌。同时排除预期生存时间<3个月及入院前已经接受化疗、放疗等抗肿瘤治疗的患者；排除合并其他原发性恶性肿瘤病史的患者；排除合并肝肾衰竭等其他严重内科疾病的患者；排除拒绝或者不能耐受化疗等不能配合完成本研究干预措施的患者。两组均签署知情同意书，且本研究在经过医院伦理委员会批准后实施。

1.3研究方案 两组均于肘正中静脉处采集外周静脉血作为检测标本。采集标本时注意将穿刺后的前2 ml弃去后，采集随后的7.5 ml静脉血加入肝素混匀后送检。富集肿瘤细胞采用密度梯度离心法，将标本与等量磷酸盐缓冲液混匀后，以2∶1比例加入细胞分离液层面上。经离心处理后，将环状乳白色单核细胞层吸出，并在磷酸盐缓冲液中洗涤2次后，再次进行离心处理。完成肿瘤细胞富集后，在载玻片上均匀涂上单个核细胞悬液，室温下静置30 min，然后以4%多聚甲醛将抗原固定，10 min后以磷酸盐缓冲液进行3次洗涤，每次5 min。以0.1%Triton X-100通透胞膜，15 min以磷酸盐缓冲液进行3次洗涤，每次5 min。5%牛血清清蛋白封闭，30 min后以磷酸盐缓冲液进行3次洗涤，每次5 min。以小鼠抗人Pan-细胞角蛋白(购自上海田源生物技术有限公司)滴加后，4℃过夜后以磷酸盐缓冲液进行3次洗涤，每次5 min。滴加FITC标记羊抗小鼠IgG(购自北京中杉金桥生物技术有限公司)，室温下孵育，2 h后以磷酸盐缓冲液进行3次洗涤，每次5 min。以7 μl 4，6-二脒基-2-苯基吲哚(北京索莱宝科技有限公司)滴于细胞区中后，盖上玻片封固。以免疫荧光显微镜对其进行观察并照相。阳性对照为对数生长的肺腺癌A549细胞株(购自北京天沃科技发展有限公司)，磷酸盐缓冲液代替一抗为阴性对照。循环肿瘤细胞阳性的判断标准〔6〕为：圆形、椭圆形或者长形细胞，核质明显大于血细胞，荧光下的细胞形态完整，且同时染蓝色和绿色荧光。光镜下尖刀细胞形态和细胞核均完整。外周血见单个核细胞为阴性对照。

1.4疗效评价标准 根据实体瘤疗效评价标准〔7〕(RECIST)，以完全缓解(CR)、部分缓解(PR)、稳定(SD)、进展(PD)进行评价。病例组患者化疗前、化疗2个周期后行循环肿瘤细胞检测，缓解(RR)：化疗后循环肿瘤细胞数较化疗前减少1个以上；SD：化疗后循环肿瘤细胞数与化疗前相同；PD：化疗后循环肿瘤细胞数较化疗前增加1个以上〔8〕。

1.5观察指标 比较两组循环肿瘤细胞的检测阳性率；比较病例组循环肿瘤细胞阳性和阴性患者的相关临床资料；收集病例组相关临床资料(年龄、性别、吸烟史、肿瘤的病理学特征等)；比较病例组化疗前后循环肿瘤细胞检测阳性率；分析RECIST评价标准和循环肿瘤细胞数评价标准评价晚期非小细胞肺癌化疗效果的相关性。

1.6统计学分析 采用SPSS21.0软件进行Fisher确切概率法、χ2检验和列联表分析。

2 结 果

2.1两组循环肿瘤细胞阳性率比较 病例组循环肿瘤细胞阳性率为60.53%(23/38)，显著高于对照组〔0.00%(0/30)，P<0.05〕。

2.2病例组化疗前后循环肿瘤细胞阳性率比较 病例组化疗后循环肿瘤细胞阳性率为34.21%(13/38)，显著低于化疗前〔60.53%(23/38),P<0.05〕。

2.3病例组循环肿瘤细胞阳性和阴性患者相关临床资料比较 循环肿瘤细胞阳性患者病理学分期Ⅳ期比例显著高于循环肿瘤细胞阴性患者(P<0.05)；两组年龄、性别、吸烟史、组织学类型、分化程度比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 病例组循环肿瘤细胞阳性和阴性患者相关临床资料比较〔n(%)〕

2.4RECIST评价标准和循环肿瘤细胞数评价标准的比较 晚期非小细胞肺癌化疗疗效采用RECIST评价标准和循环肿瘤细胞数评价标准的比较，差异无统计学意义(P>0.05)，且上述两种疗效评价标准有一定程度的吻合(κ=0.561)；相关分析结果显示，循环肿瘤细胞数与晚期非小细胞肺癌的化疗效果呈负相关关系(r=-0.442，P<0.05)，见表2。

表2 RECIST评价标准和循环肿瘤细胞数评价标准比较(n)

3 讨 论

近年流行病学研究显示，肺癌在全球范围内的发病率均呈上升的趋势，同时也是发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，肺癌的防治形势十分严峻〔9〕。晚期非小细胞肺癌治疗的难点之一在于处理肿瘤的转移病灶。循环肿瘤细胞是原发病灶和转移病灶之外的肿瘤细胞。肿瘤细胞侵袭进入血液循环后，可随血循环侵袭机体其他脏器而产生其他转移病灶。因此，监测循环肿瘤细胞有利于更早地发现肿瘤的转移情况和评估临床治疗的效果。

在本研究中，晚期非小细胞肺癌患者循环肿瘤细胞的检测阳性率为60.53%，这与孙霞等〔10〕的研究结果基本一致。同时，对照组患者无病例检出循环肿瘤细胞，这说明本研究所采用的检测方法检测循环肿瘤细胞具有较高的特异性。本研究结果说明化疗可在一定程度上清除外周血循环中的肿瘤细胞。化疗过程中监测循环肿瘤细胞也有利于评估化疗方案的有效性，对晚期非小细胞肺癌的临床治疗有一定的指导意义。冯倩等〔11〕的研究发现，进展期胃癌化疗后循环肿瘤细胞降低的患者无进展生存时间和总生存时间均显著延长，证实动态监测循环肿瘤细胞有助于评估化疗的有效性。

肺癌通过血液循环实现远处转移的前提是肿瘤细胞进入血液循环中。临床研究显示，循环肿瘤细胞检测阳性与恶性肿瘤的复发与转移、患者的预后有显著的相关性〔12，13〕。本研究结果也说明了循环肿瘤细胞阳性是晚期非小细胞肺癌远处转移的重要环节，与肿瘤发生远处转移有密切的关系。龚福生等〔14〕的研究发现，随着乳腺癌患者TNM分期的升高，循环肿瘤细胞阳性率显著升高，说明循环肿瘤细胞的检测有助于评估恶性肿瘤患者的临床分期，进而判断患者的预后。

本研究RECIST评估标准和循环肿瘤细胞数评估标准在评估晚期非小细胞肺癌化疗疗效方面有一定的吻合度。这说明循环肿瘤细胞数对晚期非小细胞肺癌的疗效评估价值与RECIST相当，这也在一定程度上反映了循环肿瘤细胞数的检测可用于晚期非小细胞肺癌的疗效评估。同时，循环肿瘤细胞数与晚期非小细胞肺癌的化疗效果呈负相关关系，这说明化疗后循环肿瘤细胞数目的变化反映了化疗的效果。边莉等〔15〕的研究发现，化疗后循环肿瘤细胞数目<5个/7.5 ml患者的无进展生存时间与基线循环肿瘤细胞数目<5个/7.5 ml患者的无进展生存时间相当，且均长于化疗后循环肿瘤细胞数目≥5个/7.5 ml患者，这说明动态监测乳腺癌患者循环肿瘤细胞数目对肿瘤的进展有预测作用。