基于肝窦毛细血管化探讨抗纤软肝方抗肝纤维化的作用机制

许 杰， 刘 艳， 楼汪洲洋， 徐 俊， 戚 露， 程良斌

1 湖北中医药大学 a.中医临床学院; b.信息工程学院; c.感染病学教研室，武汉 430060；2 宜昌市中医医院 脾胃科， 湖北 宜昌 443000；3 湖北省中医院 肝病科， 湖北省中医院肝病研究所， 武汉 430061

肝纤维化病因较多，发病机制复杂，是多种慢性肝病发展为肝硬化、肝衰竭和肝癌的重要一环[1-5]。据统计，各种原因导致肝纤维化的发病率和死亡率在全球范围内居高不下，并逐年升高，肝纤维化产生的诸多并发症严重威胁患者的生命健康，并对社会造成更为巨大的医疗负担[6]，及时准确的诊断和防治肝纤维化，对于防治肝硬化与肝癌有着极其重要的意义[7]。

肝窦内皮细胞(liver sinusoidal endothelial cell，LSEC)是构成肝窦的主要细胞，具有较多的窗孔而构成筛状，且内皮下无基底膜的存在，以助于肝细胞与血窦中各种成分的交换。肝纤维化病变时，肝窦毛细血管化，LSEC失去窗孔结构，同时内皮下基底膜形成，导致肝细胞和血窦之间的物质交换障碍，进而引起肝窦塌陷及肝细胞萎缩，最终导致肝纤维化和门静脉高压的发生；此外，LSEC表型也发生较大改变，表达血管内皮标志物分化抗原簇31(cluster of differentiation 31，CD31)和血管性血友病因子(von Willebrand factor, vWF)[8]。在对肝窦毛细血管化的评判中，认为各种原因所致的肝纤维化过程中肝窦毛细血管化可作为肝纤维化的最基本特征[9]。目前，肝窦毛细血管化形成的具体机制及其发生、发展影响因素仍不清楚。对肝窦毛细血管化形成原因、过程以及影响因素等方面进行研究，能为进一步揭示肝纤维化、肝硬化病理过程及阻断肝硬化病理进程提供理论依据[10]。

抗纤软肝方是湖北省中医院肝病科抗肝纤维化的临床效方，现为院内中成药制剂(批准文号：鄂药制字Z20113145)。主要药物由鳖甲、牡蛎、丹参、海藻、莪术等组成，具有软肝消痰、活血化瘀的功效，临床疗效已通过实验科学验证和临床认可[11-18]，课题组前期的研究已表明，抗纤软肝方可以有效改善患者肝功能，降低肝纤维化指标，但其药理学作用机制及生物学效应的物质基础仍未明确。 本研究拟从肝窦毛细血管化角度探讨抗纤软肝方抗肝纤维化的药理学作用机制。

1 材料与方法

1.1 化学药品和试剂 抗纤软肝颗粒为湖北中医院院内制剂。蛋白质提取试剂盒购自武汉阿斯彭生物科技有限公司(武汉，中国)；兔抗大鼠vWF(工作浓度为1∶150)、山羊抗大鼠CD31(工作浓度为1∶50)购自Abcam公司(Cambridge,MA, 美国)；辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG和兔抗山羊IgG、DAB显色试剂盒、小鼠抗大鼠β-actin、ECL超敏化学发光检测试剂盒均购自武汉博士德生物科技有限公司(武汉，中国)；FBS和DMEM培养基购自Gibco公司。

1.2 含药血清与细胞培养基的制备 本研究经由湖北省中医院动物伦理委员会审批[批号：鄂中医院动(福)D2018014号]，所有实验操作均符合动物实验管理规范。Wistar雄性大鼠16只，SPF级，体质量180～200 g，购自湖北省疾控中心。将大鼠分为抗纤软肝方组和对照组，每组各8只。药物剂量为60 kg成人等体质量常用剂量的6倍量，抗纤软肝方组生药40 g/kg大鼠体质量灌胃，灌胃容量为10 ml/kg大鼠体质量。采取二次重复给药的方式，即第1次灌胃给药2 h后以相同的剂量重复给药1次，第2次给药后1 h于超净台中自下腔静脉采血，再将收集的血液静置于4 ℃冰箱3 h，后4 ℃离心机中离心(3000 r/min，30 min)，超净台中分离血清，再于56 ℃水浴箱中灭活30 min，冷却后-20 ℃冰箱保存，即为抗纤软肝方组血清；对照组用生理盐水代替抗纤软肝方药物给大鼠灌胃，余处理均与抗纤软肝方组相同，获取对照组血清。抗纤软肝方组血清与对照组血清均分别以10%的浓度加入DMEM配置成含血清培养基用以细胞培养。最后将配制的培养基经0.22 μm滤器除菌待用。

1.3 细胞培养与分组 原代LSEC，由武汉原生原代生物公司提供，经传代培养后分为抗纤软肝方组(母方组，MF)及对照组(Control)，分别用10%浓度的含药血清和对照血清进行培养，置于37 ℃含5% CO2的温箱中培养。

1.4 方法

1.4.1 血免疫细胞化学法 接种于铺有盖玻片的6孔板，培养48 h后检测，一抗分别为兔抗大鼠vWF和山羊抗大鼠CD31，二抗分别为辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG和辣根过氧化物酶标记的兔抗山羊IgG。细胞爬片经固定、破膜、封闭、抗体孵育及DAB显色后，显微镜下观察并拍照，每张载玻片上取8个高倍视野，用Image-Pro Plus 6.0软件进行吸光度值分析。

1.4.2 Western Blot 用SDS-PAGE凝胶电泳分离的原代LSEC提取物行蛋白质印迹检测，然后转移到硝酸纤维素膜过滤器上。含5%脱脂奶的PBS溶液封闭过夜，检测vWF和CD31一抗工作浓度分别为1∶1000和1∶200，内参β-actin工作浓度为1∶2000，经一抗和二抗孵育及ECL超敏化学发光检测试剂盒曝光，曝光15 min，用Image Lab软件进行灰度值测量分析。

1.4.3 扫描电镜观察肝窦内皮窗孔的变化 6孔板中经抗纤软肝方血清与对照血清培养的LSEC，PBS清洗3次后，每孔加入2 ml的电镜固定液，4 ℃冰箱保存，进行扫描电镜检测LSEC窗孔结构的变化。

2 结果

2.1 抗纤软肝方对LSEC形态的影响 采用免疫细胞化学法对原代LSEC进行鉴定，经复合染色确定为原代LSEC(图1a)。采用倒置显微镜观察LSEC的形态，与对照组比较，抗纤软肝方组对LSEC形态学无明显影响(图1b)。

注：a，免疫细胞化学法对LSEC鉴定(×200)；b，抗纤软肝方对LSEC形态影响(×100)。

图1LSEC鉴定与形态学观察

2.2 抗纤软肝方对LSEC中CD31和vWF细胞因子的影响 在LSEC中CD31主要表达在胞质中，vWF在胞质和胞核中均有表达。与对照组比较，抗纤软肝方组CD31和vWF表达水平降低，差异具有统计学意义(CD31: 0.069±0.015 vs 0.115±0.011,t=4.257,P<0.05; vWF: 0.092±0.009 vs 0.132±0.014,t=4.274,P<0.05)(图2)。

2.3 抗纤软肝方对LSEC窗孔结构的影响 如图3所示，对照组LSEC表面窗孔狭小，数量减少，许多窗孔结构将近闭塞甚至消失;而抗纤软肝方组LSEC窗孔结构清晰，窗孔增多、增大，明显可见，且基底膜明显减少。

2.4 抗纤软肝方对LSEC分子机制的影响 与对照组相比，经抗纤软肝方组治疗后CD31、vWF的蛋白水平下降，差异具有统计学意义(CD31：0.334±0.029 vs 0.448±0.013,t=6.245,P<0.01; vWF: 0.560±0.047 vs 0.709±0.045,t=3.966,P<0.05)(图4)。

3 讨论

当前，肝纤维化无创性诊断和有效干预尚不尽人意，单一药物的疗效可能有限，可能需要联合及多靶点尝试治疗[19]。对于肝纤维化的防治，大量研究[20-22]表明，通过早期及时诊断并针对其原发致病因素的有效治疗，肝纤维化能被有效阻断，甚至逆转，可以达到肝硬化不同程度的减轻与缓解。对肝窦毛细血管化的研究已有半个多世纪，而进一步加强对肝窦毛细血管化的研究，对于阐明肝纤维化的发病进展机制以及逆转肝纤维化、肝硬化方面，意义深远[9]。肝窦毛细血管化的具体分子机制至今仍未清楚，而肝纤维化过程中肝窦毛细血管化与肝星状细胞、Kupffer细胞活化之间的关系，LSEC与细胞微环境之间关系的研究已经成为目前肝纤维化具体分子机制研究的热点问题。

近年针对肝纤维化的不同靶点、抑制肝星状细胞活化与增殖、增强基质金属蛋白酶活性及抑制金属蛋白酶组织抑制剂的活性、抑制炎症反应、调节免疫反应的药物及中药，以及纳米颗粒与抗纤维化药物结合的治疗和基因治疗取得显著的进展[5,23]。抗肝纤维化的治疗，主要包括两方面：一是针对原发病的病因治疗，如抗肝炎病毒、抗血吸虫病、戒酒、祛铁和祛铜等控制或治愈原发病；二是针对抗肝纤维化本身的治疗，也是目前临床和实验研究的热点和重点，如抑制肝星状细胞的激活、抑制胶原的增生、抑制TGFβ的过表达、促进胶原的降解等，但目前多数治疗处于实验研究阶段[24-25]。

中医认为肝纤维化为痰瘀互结之证，抗纤软肝方具有软肝消痰、活血化瘀的功效，进而起到抗肝纤维化的作用。本文通过细胞实验研究，探讨抗纤软肝方对肝窦毛细血管化的作用机制和抗肝纤维化的效果，通过对肝纤维化原代LSEC免疫细胞化学、Western-Blot检测和扫描电镜检测发现，抗纤软肝方具有明显的抗肝窦毛细血管化，改善肝纤维化的作用。

LSEC既可以参与肝脏的再生，发挥保护作用，又可以参与肝纤维化的发生发展[26]。原代LSEC在体外经传代培养，会发生毛细血管化现象，但其发生的分子机制仍不清楚[8]。为进一步从肝窦毛细血管化的角度明确抗纤软肝方对肝纤维化的影响，本研究通过扫描电镜检测LSEC，结果发现对照组LSEC结构不清，窗孔减少明显，提示肝窦毛细血管化可能是肝纤维化痰瘀互结的重要病理学基础。而抗纤软肝方可明显改善LSEC肝窦毛细血管化的表现，改善窗孔结构，增加LSEC窗孔。

CD31、vWF是反映肝窦毛细血管化的重要客观指标[27]。为深入探究抗纤软肝方抗肝窦毛细血管化的分子机制，本研究通过Western-Blot和免疫细胞化学法测定LSEC中CD31、vWF的蛋白表达，结果表明，抗纤软肝方组可显著降低CD31、vWF的蛋白表达水平，明显改善LSEC其肝窦毛细血管化程度，这可能是其改善LSEC肝窦毛细血管化，从而达到抗肝纤维化作用的分子机制之一。