去细胞基质水凝胶的治疗研究进展

黎 婷，张海燕

(芜湖职业技术学院生物工程学院，安徽芜湖 241003)

0 引言

目前，去细胞支架越来越多的应用到了组织工程中，如骨损伤、糖尿病溃疡等外科临床手术中，来源于人皮肤、猪小肠粘膜下层和膀胱等组织器官的去细胞基质水凝胶[1]，已被用于组织修复材料，如心肌衰弱、肝脏、气管和食管等器官的修复[2-4].去细胞基质可通过2种常用方法制备可注射的水凝胶：一种方法是将去细胞基质研磨成粉末，用液体溶解后进行注射，例如骨基质、膀胱基质等[5]，这种方法应用较少；另一种方法是利用胰酶等消化基质，消化后的基质可自动形成纳米纤维水凝胶，与体内pH等生理条件更为匹配，相比第一种方法更具临床应用优势[6]，还可以与生长因子等联合应用，更作为生物墨水材料应用于组织的3D打印[7]，该方法制备的去细胞基质水凝胶应用更为广泛.

1 器官修复作用

1.1 心肌

去细胞基质水凝胶在心脏疾病中主要用于心肌梗塞，如猪心基质水凝胶已用于临床心肌梗塞患者的治疗，通过重构心脏特殊的心肌细胞微环境来吸引内源细胞迁移来帮助修复.这种心脏基质水凝胶还可以用于血液相容性组织的修复，由于使用酶消化制备的水凝胶含有大量的胶原成分[8]，通过激活血小板起到激动剂的作用[9].这种治疗方式可大大提高心肌增殖、新血管形成，从而修复心脏功能[10].越来越多的研究致力于探明修复机制，如Wawwenaar等将大鼠心肌梗塞使用水凝胶治疗进行RNA全转录组分析，发现在心脏修复相关通路中，如血管生成、心脏转录等因子显著上调，而炎症、细胞凋亡和纤维化等因子显著下调，刺激心肌生成[11].

制备水凝胶的组织器官来源中，猪、山羊和人等不同来源的心肌已在体外实验中证实其可使用性，而猪小肠粘膜下层、人胎盘及猪和人的心包由于无组织特异性，作为自体同源组织材料，已分别应用于猪和人的体内实验[[12-13]，结果显示梗死面积显著缩小[14].去细胞基质水凝胶也已经用于心脏组织的3D打印，使用人心肌祖细胞作为种子细胞，证实了新血管发生，移植到裸鼠的心肌梗塞模型后，心脏功能显著增强[15].在大鼠心肌梗塞模型中，心包去细胞基质水凝胶与生长因子，如bFGF和HGF联用治疗，实验结果显示小动脉发生数显著增加，新生成的血管与原有血管发生吻合，实现通血[16].综上所述，在心脏疾病治疗中应用去细胞基质水凝胶，可促进细胞增殖和迁移，新血管生成，心脏功能显著改善.

1.2 运动器官

1.2.1 骨骼肌 骨骼肌常发生急性损伤，或因外周动脉疾病造成缺血性损伤和萎缩，多种不同来源器官的去细胞基质水凝胶已用于骨骼肌的修复研究.在大鼠后肢缺血性损伤模型中，使用猪骨骼肌与人脐带去细胞基质水凝胶进行注射治疗，二者内皮细胞增殖、动脉生成、肌细胞增殖及骨骼肌祖细胞迁移等均显著增加，但在肌纤维形态学上，前者要优于后者[17-18].在大鼠腹壁肌肉缺损模型中，使用猪真皮去细胞基质水凝胶与聚合材料通过电喷射技术在静电纺纱材料上凝胶化，移植于缺损部位4周后，经过力学分析发现修复部位硬度几乎达到天然组织硬度，移植部位经HE染色，显示大量巨噬细胞和肌动蛋白阳性细胞迁移[19]；与使用膀胱去细胞基质水凝胶治疗对比，后者降解更快，肌发生更显著[20].

1.2.2 肌腱 肌腱和韧带损伤会引起组织撕裂和运动功能障碍，注射水凝胶在二者治疗中效果良好，如Farnebo使用人肌腱去细胞基质水凝胶进行肌内注射，引起纤维原细胞、脂肪干细胞及巨噬细胞大量增殖[21].由于肌腱通血功能差，在大鼠肌腱损伤模型中，单独使用水凝胶进行注射治疗4周后，并未形成肌腱，但是添加富血小板血浆及脂肪干细胞后，形成肌腱，且力学测定，如弹性系数等效果好[22].由于人肌腱供体有限，目前选择猪和马作为异种肌腱供体[23]，体外实验显示经过冻干处理后，细胞增殖率和细胞活性更高[24].

1.2.3 关节软骨 关节软骨再生能力差，目前常使用微裂缝手术促使软骨再生，但是临床效果差强人意.可注射水凝胶结合种子干细胞或者生长因子联用成为一种可替代的方法，Kwon首次使用猪软骨去细胞水凝胶用于大鼠软骨损伤的注射治疗[25]，多个研究使用不同物种的软骨去细胞水凝胶进行了体外实验，以期获得最好的细胞反应和力学特性，如去细胞过程和酶消化过度会造成水凝胶力学脆弱，重塑能力差[26-27].

1.2.4 骨 缺乏血液供应和相关的生长因子造成骨折后不愈合或愈合效果差，去细胞基质水凝胶注射在骨折区域可传递外源性生长因子，或招募内源性生长因子[28].制备骨去细胞基质水凝胶时需通过盐酸处理脱钙，否则水凝胶无法凝胶化[29].研究发现，注射水凝胶修复骨折时，联用人骨基质细胞与骨形态蛋白2，骨基质形成和胶原沉积增加，而不同的种子细胞和生长因子的修复效果有所差别[30].

1.3 神经组织

1.3.1 脑 缺血或外伤造成的皮质损伤会分别引起缺血性或者创伤性脑损伤，均可使用水凝胶注射进行治疗.DeQuach首先使用猪脑制备水凝胶培养神经元[31]，Bible开始了水凝胶联合神经干细胞注射治疗大鼠中风模型的体内研究，但是核磁共振结果显示并没有形成神经纤维以及与神经网络中其它细胞的连接[32].分别使用膀胱、脐带与脑去细胞基质水凝胶联合间充质干细胞注射治疗中风性脑损伤，结果显示水凝胶浓度高于3 mg/mL，在体内才会凝胶化，而浓度为8 mg/mL时，内生性修复效果最好；不同器官去细胞基质水凝胶均会促使间充质干细胞向神经干细胞的分化，以及内源性细胞向损伤区域的迁移；在脑损伤区域的修复程度上，不同器官制备的去细胞基质水凝胶并不是关键，脑组织特异性细胞(如神经干细胞)才是功能恢复的关键[33-34].

1.3.2 脊髓 脊髓损伤会导致损伤平面下丧失感觉和运动功能，水凝胶治疗旨在愈合脊髓缺口，形成新的神经连接.已有研究报道了多种猪脊髓去细胞基质水凝胶的制备方法和体外研究结果，显示出其促进神经元的增殖、迁移和分化，以及神经元突起的形成[35].猪脊髓和膀胱去细胞基质水凝胶在大鼠脊髓损伤模型的修复应用中，细胞增殖、迁移和分化无显著差异，与人间充质干细胞联用治疗，血管生成和神经元突起形成的结果也无显著差异，但是以上实验中水凝胶都迅速分解[36].在今后水凝胶修复脊髓损伤的研究中，更倾向于对水凝胶进行更好的修饰以期减少分解，以及选择更理想的种子细胞.

综上所述，在多种器官修复的研究中，如肝[37]、结肠[38]、肺[39]、胰腺[40]等器官，相较于目前的其它临床生物材料，水凝胶与受体微环境更为匹配，种子细胞的增殖、迁移及分化及也更为显著.

2 移植条件

2.1 组织来源

不同组织制备的可注射基质水凝胶成分有所差别，这种差别尤以影响水凝胶的机械性能以及扩展性，组织主要选自于异种动物，尤其是猪源或牛源，来源于人活体的捐献非常少，大多数来自死者的捐献[41].同种及异种组织来源的对比研究发现，活体异种组织机械性能更好；自体同源组织，如心包和大网膜等组织由于取样时手术创口大而量少，并没有实际应用价值；异体同源组织常来自于病体，制备水凝胶难度加大，而水凝胶的粘多糖和胶原成分与来自于正常机体组织的有显著差别[22,42].因此，目前在临床使用的去细胞基质水凝胶，多是来源于异种动物组织的生物商品.

2.2 供体年龄

供体年龄越大，去细胞基质水凝胶注射后的凝胶化状态越差，脂肪沉积和纤维化加剧.Sood等团队发现，使用不同年龄组织制备的水凝胶体外培养神经元与人间充质干细胞，年龄越小，神经元增殖、突触联系、神经网络形成的状态越好，间充质干细胞增殖和分化状态越好[43-44].因此，在制备去细胞基质水凝胶时，应选择年龄小的供体器官组织，在组织工程的应用中效果更好，如一些动物的胚胎组织已有应用.

2.3 组织特异性

不同组织基质的结构和组成有一定的差异，形成每种组织独特的微环境和生化功能，经过去细胞处理仍然保留一定的组织特异性成分，包括标记蛋白、生长因子和组织结构.French团队发现与脂肪等组织基质相比，心脏基质中心肌祖细胞表达的早期心肌标记蛋白含量有显著性差异[45]；Viswanath团队使用脊髓、骨骼和牙基质体外培养间充质干细胞，在脊髓基质中培养的间充质干细胞向舌乳头分化的数量更多[46].因此在组织工程的应用中，应选择结构更匹配的组织，是因基质诱导种子干细胞向组织特异性细胞系分化潜力更大.

2.4 灭菌

目前基质水凝胶的灭菌技术和无菌状态并没有统一衡量标准，去细胞步骤主要包含去除细胞成分(洗涤剂或酶处理)、酸处理和灭菌(抗体、射线处理[47]).最终的灭菌处理步骤会显著影响基质支架的机械性能，对乙烯、γ射线和电辐射进行无菌处理比较，机械性能有显著差别，乙烯处理优于电辐射及γ射线[48].今后组织工程中基质水凝胶的研究，需要探索全新的灭菌方式，保证其体内应用生物活性的保留.

3 可能的修复机制

去细胞基质是从组织或器官制备的天然支架，去除细胞和细胞核成分，但是保留了组织或器官的三维空间结构(仍然保留了部分胶原纤维等天然纤维成分)；支架具有生物活性和生物相容性，相对于用于进行自体或异体移植的其它人工生物工程材料，去细胞基质展现了没有免疫排斥的优势；研究发现，去细胞基质水凝胶中保留了大量的细胞生长因子，如成纤维生长因子、转化生长因子和肝细胞生长因子等，可以吸引种子细胞的生长、迁移、增殖和分化，以及血管发生。这种与种子细胞之间的“实时互动”，可以更好的重塑组织、器官的结构，对组织与器官的再生与功能修复有着重要的意义[1].

4 展望

已有的研究结果已证实去细胞基质水凝胶作为支架在多种器官损伤治疗的修复作用，表现在促进细胞增殖、迁移与新血管生成等方面，但是修复机制尚未明确.去细胞基质水凝胶的应用刚起步，仍有许多的研究空间.在再生医学中，伴随着去细胞基质水凝胶的选择、制备方法和修饰等条件的日益成熟，以及修复机制的深入阐释，将更加完善其在器官功能的修复治疗效果.尤其是新技术如3D打印的出现，会越来越适应器官的复杂性，而结合理想的种子细胞及生长因子，器官功能的修复也会日益加强，为再生医学的发展提供了新的方向.