lncRNA调控肺癌及以lncRNA为靶点的中药抗肺癌治疗的研究进展

李小娜，李开瑞，宋 岚

（1. 湖南中医药大学 a. 研究生院；b. 医学院，长沙 410208；2. 中医药防治眼耳鼻咽喉疾病湖南省重点实验室，长沙 410208；3. 湖南省中医药防治眼耳鼻咽喉疾病与视功能保护工程技术研究中心，长沙 410208）

约70%的人类基因组DNA会被转录为RNA，在这当中只有不到2%的序列可编码成蛋白质，非编码RNA的数量极其庞大［1］。但由于认识不足，许多非编码RNA在过去被认为是基因组转录过程中的“杂章”［2］。大量研究表明，这些非编码RNA在蛋白质翻译、DNA复制、基因转录调控、染色体的形成和结构稳定、组织器官的发育和分化等生物学过程中起着重要的作用，并且与许多疾病的发生发展关系密切［3］。越来越多的证据表明，异常表达的长链非编码RNA（long non-coding RNA, lncRNA）可以直接通过与蛋白质、DNA或mRNA相互作用，来调节染色质的结构、转录、剪接和翻译，从而调节肺癌的生理和病理过程，为肺癌的治疗和研究提供新的方向和切入点。一直以来，中医药治疗是我国肺癌综合诊治体系的重要组成部分，多途径、多靶点的综合干预是其主要的作用优势。以lncRNA为靶点的中医药抗肺癌机制研究已经引起了学者关注，并逐步成为研究的热点。

1 lncRNA概述

1.1 lncRNA简介

lncRNA多是由RNA聚合酶II进行编码和剪接的一类转录长度超过200 bp且无蛋白质编码功能的RNA，主要分布在细胞质和细胞核内，可对细胞内多种生命活动起调节作用［4］。根据lncRNA与蛋白编码基因的位置关系，可将其分为五大类，即基因间型lncRNA、正义lncRNA、反义lncRNA、双向lncR和内含子lncRNA［5］。基因间型lncRNA的编码区域位于两个蛋白质编码基因的中间，不与编码基因的内含子和外显子重叠；正义lncRNA与编码蛋白质的基因在同链中产生，与编码基因的一个或多个外显子重叠；反义lncRNA是一类从编码基因反向转录的lncRNA；双向lncRNA的表达不仅与邻近蛋白质编码基因的转录产物的方向相同，且两者位于同一条链上，所以它与蛋白质编码基因共享相同的启动子，但转录方向相反；内含子lncRNA是在基因内含子区域编码的lncRNA。

1.2 lncRNA的主要作用机制

lncRNA主要通过调节蛋白质编码基因的转录和翻译而在多种生物学过程中发挥作用［6］。其可通过转录水平、转录后水平和表观遗传学三个层面实现对靶基因的调控。

转录水平：1）lncRNA作为转录因子或RNA聚合酶II的诱饵破坏其与靶基因启动子或增强子的结合，从而促进或抑制基因的表达；2）直接与转录因子相互作用，更改其修饰或定位来调节基因的转录；3）与DNA相互作用并充当转录因子的支架，从而影响靶基因的转录；4）作为内源竞争性RNA（competing endogenous RNA, ceRNA）来控制目标基因的转录［7-10］。

转录后水平：1）调控pre-mRNA的选择性剪接以产生不同的转录本；2）与mRNA形成双链RNA复合物并保护其免受降解［11-12］。

表观遗传学：1）参与DNA甲基化；2）调控染色质重塑 ；3）调控组蛋白修饰［13］。

2 与肺癌相关的lncRNA及其作用机制

研究发现，lncRNA在多种肿瘤中异常表达，并且lncRNA表达失调在肿瘤的发生发展中起着重要的作用，对疾病的诊断和治疗有指导性意义［14］。lncRNA主要通过以下机制发挥抗肿瘤作用：1）促进不同转录因子间结合；2）诱导染色质中转录因子或其他调节蛋白失活；3）引起染色质结构改变；4）通过与染色质的相互作用诱导修饰组蛋白；5）通过其他蛋白质介质（如lncRNA-p21）与DNA甲基转移酶的相互作用等方式调控与癌症相关的基因表达，进而发挥抗癌作用［15］。大量lncRNA在肺癌中存在差异性（上调或下调）的表达，这些lncRNA能通过调节蛋白编码基因的翻译和转录及表观遗传学（染色质重塑和DNA甲基化）来影响肺癌的发生和发展［16］。

2.1 肺癌中表达上调的lncRNA

2.1.1 同源异型基因转录反义RNA （HOTAIR）

同源异型基因转录反义RNA（homeotic genes transcript antisense RNA, HOTAIR）的转录物长度为 2.2 kb，多通过招募多梳蛋白抑制复合物2（polycomb repressive complex2, PRC2）或染色质重组来增强多种肿瘤细胞的侵袭和转移［17］。Jiang等［18］采用荧光实时定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）检测发现 HOTAIR在非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）的组织和细胞系（H1299、H23、H292和A549）中均呈高表达水平。进一步研究发现，HOTAIR和miR-613之间存在调控关系。当HOTAIR被敲低后，miR-613的表达增加，可抑制NSCLC的增殖和转移。Rui等［19］研究发现，HOTAIR诱导的HOXA1甲基化可通过调节核因子 -κB（nuclear factor kappa-B,NF-κB）途径来增强小细胞肺癌（small cell lung cancer,SCLC）的化学耐药性，NF-κB抑制剂可用于治疗存在HOTAIR高表达的化疗耐受肺癌患者。HOTAIR也是NSCLC细胞周期失调的指标之一，高表达HOTAIR可加快NSCLC细胞从G1期到S期的进程，促进NSCLC细胞的增殖、侵袭和转移［20］。通过这些结果可推测，HOTAIR是肺癌的独立预后生物标志物和治疗靶标之一。

2.1.2 转移有关的肺腺癌转录本1（MALAT1）

转移有关的肺腺癌转录本1（metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1, MALAT1）也称为非编码富核丰富转录本2（nuclear-enriched abundant transcript, NEAT2），是位于染色体11q13上高度保守的lncRNA［21］。MALAT1是最早发现与肺癌有关的lncRNA之一，它可被用于预测I期肺癌或鳞状细胞癌患者的生存质量和期限［22］。孙秀凤等［23］采用实时定量PCR和Western blot等试验方法检测发现肺癌组织中MALAT1的表达水平显著高于癌旁正常组织。同时该研究还发现，敲低MALAT1的表达水平可抑制NSCLC细胞的增殖、侵袭及迁移并诱导凋亡，其作用机制可能与调控细胞增殖周期相关的核抗原（Ki67）及凋亡相关蛋白半胱氨酸蛋白酶9（caspase 9）的表达有关。也有研究表明，MALAT1也可通过调控miR-202的表达来参与NSCLC细胞的增殖和侵袭过程［24］。上述研究表明，MALAT1在肺癌的预后及早期诊断方面具有重要意义。

2.1.3 H19

H19是位于染色体11p15.5上被广泛研究的lncRNA之一［25］。已有研究证实，H19能在表观遗传和转录水平上调控肿瘤细胞的增殖、分化和凋亡［26］。肿瘤抑制因子p53是H19转录过程中的重要阻遏物，当p53表达减少或突变导致其活性降低时，H19的表达水平相应上升［27-28］。Zheng等［29］研究也证实了H19和p53之间存在调控关系，深入研究发现H19可通过上调miR-675-5p进而减弱p53和Bax的表达水平，使NSCLC细胞无限增殖。H19还可通过降低miR-200a的表达进而减弱miR-200a靶基因的E盒结合锌指蛋白 1（zinc figer E-box-binding protein 1, ZEB1）和 E 盒结合锌指蛋白2（ZEB2）的表达，增强肺腺癌的侵袭和迁移能力［30］。

2.1.4 结肠癌相关转录物2（CCAT2）

结肠癌相关转录物2（colon cancer-associated transcript2, CCAT2）是位于染色体8q24.21上具有高度保守性的lncRNA［31］。查阅文献发现，CCAT2最早在结肠癌中发现，并且与肿瘤细胞的增殖、凋亡及化疗耐药性紧密相关［32］。Qiu等［33］研究发现，CCAT2在NSCLC细胞组织中呈高表达状态，约为癌旁组织的7.5倍，高表达的CCAT2可加快NSCLC细胞的增殖与侵袭的进程，且其与肿瘤分期及不良预后密切相关。还有研究发现，高表达的CCAT2可增加NSCLC细胞（细胞质和细胞核）中的β-连环蛋白（β-catenin）表达，Wnt信号通路被激活，从而促进NSCLC细胞的增殖和迁移［34］。

2.1.5 浆细胞瘤变异易位基因1（PVT1）

浆细胞瘤变异易位基因 1（plasmacytoma variant translocation 1, PVT1）位于染色体8q24上，其转录本长度为 1 957 bp［35］。PVT1 驻留在 Myc癌基因附近，并通过以下途径发挥作用：1）参与DNA的重新排列；2）增强Myc蛋白的稳定性；3）通过结合特定DNA、RNA或招募转录因子等方式调控肿瘤相关基因的表达［36-37］。Cui等［38］采用荧光实时定量PCR对NSCLC细胞系（A549、H157、H226、H460和HCC827）和NSCLC组织进行检测，发现PVT1均呈高表达，并且其与NSCLC患者的肿瘤病变范围（tumor node metastasis classi fication, TNM）分期紧密相关，高表达PVT1促进NSCLC细胞异常增殖的机制与其抑制p15和p21的表达有关。PVT1也可通过抑制miR-29c的表达来上调血管内皮生长因子的表达水平，加快肿瘤血管生成，从而使得NSCLC细胞过度增殖［39］。PVT1也可作为miR-216b的ceRNA，通过调控miR-216b/Beclin-1通路参与NSCLC组织细胞的凋亡和自噬，并可增强NSCLC细胞对顺铂的耐受性［40］。

2.2 肺癌中表达下调的lncRNA

2.2.1 母系表达基因3（MEG3）

母系表达基因 3（maternally expressed gene 3,MEG3）位于染色体14q32.2上，是一种在正常组织中普遍表达但在人类多种肿瘤细胞组织中呈低表达状态的lncRNA［41］。Zhao等［42］采用荧光激活细胞分选方式在肺癌中确定了肺癌干细胞（lung cancer stem cell, LCSC），继而检测了LCSC中MEG3、miR-650和溶质载体家族 34 成员 2（recombinant solute carrier family 34 member 2, SLC34A2）的表达水平及其相互的调控关系，发现MEG3在LCSC中呈低表达状态。其可作为ceRNA抑制miR-650的表达，使SLC34A2的表达提高，从而抑制LCSC的侵袭和转移。Wu等［43］发现，MEG3一方面可作为ceRNA抑制microRNA-7-5p的表达，通过提高乳腺癌1号基因（breast cancer 1,BRCA1）的表达来抑制NSCLC细胞的增殖；另一方面可直接抑制B淋巴细胞瘤-2（B lymphoblastoma-2,Bcl-2）和上调Bax的表达来促进NSCLC细胞凋亡。也有研究发现，经帕博西林（palbociclib）处理后的A549及SK-MES-1细胞存在Rb（retinoblastoma）信号通路的激活，可导致DNA甲基转移酶1的表达降低，从而提高MEG3的表达水平，抑制肺癌细胞的增殖［44］。上述大量研究表明，MEG3及其亚型可作为一个新型的lncRNA肿瘤抑制因子。

2.2.2 BRAF激活的非编码RNA（BANCR）

BRAF激活的非编码RNA（BRAF-acticited long non-coding RNA, BANCR）位于q21.11染色体上，全长为 693 bp［45］。已有研究证实，BANCR 在NSCLC和SCLC细胞中均呈低表达状态，BANCR可通过上调E钙黏蛋白（E-cadherin）以及下调N钙黏蛋白（N-cadherin）和波形蛋白（V-imentin）等方式抑制NSCLC细胞的侵袭和迁移［46］。Yang等［47］用实时定量PCR检测了NSCLC的6种细胞系（A549、H1975、H1299、H1650、SPC-A1和PC-9）、NSCLC小鼠模型和30例人NSCLC肺肿瘤组织，发现BANCR均呈低表达状态，且其可通过激活caspase3/7和降低Bcl-2的表达进而抑制NSCLC细胞的生长。Jiang等［48］研究发现BANCR可使p38和JNK信号通路失活，进而调控丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）通路抑制肺癌细胞的增殖和迁移。综上所述，BANCR可作为监测肺癌转移与预后的指标，并有望成为肺癌化疗的新靶点。

2.2.3 生长阻滞特异性转录因子5（GAS5）

生长阻滞特异性转录因子5（growth arrest-special transcript 5, GAS5）位于染色体1q25.1上，由12个外显子及11个内含子组成，转录后长度为651 bp［49］。Dong等［50］采用实时定量PCR检测发现，NSCLC细胞系（A549、H460、95D、H1299、SPC-A-1和H522）中的GAS5表达水平明显低于正常肺部细胞16-HBE。深入研究发现，GAS5可作为miR-205的ceRNA调节第10号染色体同源丢失性磷酸酶张力蛋白基因（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten, PTEN）信号通路，GAS5可使PTEN的信号通路失活，下调miR-205的表达，抑制NSCLC细胞的增殖。GAS5可降低miR-135b的表达， 抑制NSCLC细胞的增殖，并增强肺癌患者对放化疗的敏感性［51］。GAS5可作为NSCLC诊断和预后的潜在标志，其表达量与肿瘤大小（P＜0.05）以及TNM分期（P＜0.05）相关［52］。

2.2.4 重组人快速发育生长因子4-内含子转录体1（SPRY4-IT1）

重组人快速发育生长因子4-内含子转录体1（recombinant human sprouty homolog 4 intronic-transcript,SPRY4-IT1）是位于5q31.3染色体上的lncRNA，长度为702 bp。Sun等［53］采用定量PCR检测发现，在NSCLC患者细胞和NSCLC细胞系（SPC-A1、A549和SK-MES-1）中SPRY4-IT1的表达水平均显著下调，且SPRY4-IT1的表达水平与肿瘤大小和淋巴结转移紧密相关。此外，SPRY4-IT1可通过上调E-cadherin、下调V-imentin的表达水平抑制肺癌细胞上皮间质转换（epithelial-mesenchymal transition, EMT）过程，降低NSCLC细胞的侵袭和转移能力。Ye等［54］采用实时定量PCR方式检测发现，顺铂耐药肺腺癌A549（A549/Cisplatin, A549/DDP）细胞中 SPRY4-IT1呈低表达，MPZL-1呈高表达。同时RNA测序表明，MPZL-1可能是SPRY4-IT1的靶标，它们之间存在负调控关系。SPRY4-IT1可通过下调MPZL-1抑制A549/DDP细胞EMT，从而逆转A549/DDP顺铂耐药性增强化疗敏感性。由此，SPRY4-IT1可作为NSCLC潜在的治疗靶标。

2.2.5 肿瘤易感性候选基因2（CASC2）

肿瘤易感性候选基因 2（cancer susceptibility candidate 2, CASC2）位于10q26染色体上，是一种常见的抑癌因子。已有研究表明，与正常肺部细胞组织相比，CASC2在NSCLC细胞组织中表达水平显著降低，且CASC2表达量与肿瘤恶变程度和TNM分期变化呈负相关，因此CASC2的表达水平减少预示着NSCLC患者预后不良［55］。Xiao等［56］采用实时荧光定量PCR检测CASC2在顺铂耐药的NSCLC组织和细胞系中的表达水平，结果发现CASC2的表达水平均下调。此外，深入研究发现， CASC2可通过与miR-18a的互补位点结合作为ceRNA来抑制miR-18a的功能，使顺铂耐药的NSCLC的增殖和生长受限。

2.3 在SCLC中高表达但在NSCLC中低表达的lncRNA牛磺酸上调基因1（TUG1）

牛磺酸上调基因 1（taurine upregulated gene 1,TUG1）是位于22q12.2染色体中的lncRNA。其已被证实在各种与肿瘤相关的生物学过程中均起着至关重要的调节作用，且与肿瘤体积增大、病理分期及远处转移密切相关［57］。Niu等［58］发现，TUG1在SCLC中呈高表达状态。深入研究发现，TUG1通过与zeste同源物2（zeste homolog 2, EZH2）结合调节LIM激酶2的一个剪接变体（a splice variant of LIM-kinase 2, LIMK2b）来参与SCLC的细胞生长过程。敲低TUG1可增强NSCLC细胞对化疗的敏感性，并可诱导其凋亡。但Zhang等［59］通过研究分析192例NSCLC组织和相应癌旁组织发现，TUG1在NSCLC中呈低表达，其可上调HOXB7（促癌基因）的表达，促进NSCLC细胞的增殖。p53/TUG1/PRC2/HOXB7的相互作用可作为NSCLC 诊断和治疗的靶标。

3 以lncRNA为靶点的肺癌中医药防治

中医药疗法是我国肺癌综合治疗方法的重要组成部分，虽然近年来研究者们对中医药疗法多途径、多靶点的作用机制做了较深入研究，但是围绕lncRNA 为靶点的中医药防治肺癌研究尚处于起步阶段。目前已经报道的研究有：肺岩宁方通过下调MALAT1的表达，使Wnt/β-catenin信号通路失活，从而抑制A549细胞的侵袭和转移［60］；益气除痰方也可下调MALAT1的表达，抑制Smad2/3磷酸化，并可参与肺癌细胞EMT过程，调控肺癌的侵袭和转移［61］；中药单体白藜芦醇可通过下调lncRNA BC043009（类似癌基因样的功能）的表达抑制NSCLC细胞的增殖，或使其阻滞于G0/G1期［62-63］；中药单体鱼腥草酸钠可通过下调Linc00668抑制NSCLC的生长和转移［64］；中药单体紫杉醇可通过上调MEG3和激活抗癌基因p53抑制NSCLC细胞的增殖，并诱导其凋亡［65］。

4 总结与展望

肺癌是全球发病率和死亡率最高的恶性肿瘤［66］，关于肺癌发病机制的研究也在不断深入，然而其发病机制尚未阐释清楚。随着分子生物技术和高通量测序技术的发展，已有大量研究证实，lncRNA在NSCLC患者血液和体液中存在异常表达，有望为肺癌的诊断、治疗和预后提供新的靶点和分子标记物。由于IncRNA本身作用方式的多样性及不确定性，其在NSCLC中的作用及机制方面尚存在诸多关键问题需要解决。例如：1）lncRNA调控上下游信号通路的具体机制；2）lncRNA参与耐药性机制；3）现在的技术手段可否将在体内表达水平较低但较重要的lncRNA检测出来？4）如何将治疗性的lncRNA递送到靶组织中并评估其安全性？5）如何将促进癌细胞发展的lncRNA敲除？6）中药如何调控lncRNA，使其发挥抗肺癌作用？但lncRNA作为一个新的研究方向，以其为靶点的现代中医药抗肿瘤研究必定会为阐明中药抗肿瘤机制提供新的思路；围绕lncRNA为靶点研究的抗肿瘤新药也必定会为肿瘤临床治疗带来新的发展和机遇。