环状RNA 作为肿瘤标志物及其在肿瘤放疗中应用的研究进展

郭新园 王蕊 衣峻萱 金顺子

吉林大学公共卫生学院，国家卫健委放射生物学重点实验室，长春 130021

放疗是恶性肿瘤的3 大治疗手段之一，但肿瘤细胞的放疗抵抗是导致肿瘤患者放疗失败和预后不良的重要因素[1]。环状RNA（circular RNA，circRNA）是一类新型的内源性共价闭合环状非编码RNA，无5'末端帽结构及3'末端多聚A 尾[2]。circRNA 的数量丰富，具有较高的细胞和组织特异性。circRNA独特的结构使其对核糖核酸酶不敏感，能够完整且高度稳定地存在于各种组织和体液中。这些特性使circRNA 成为肿瘤诊断、治疗和判断预后的理想非侵入性生物标志物[3]。近年来，由于高通量测序和生物信息学技术的飞速发展，circRNA 成为了继微小RNA（microRNA，miRNA）及长链非编码RNA 后RNA 家族在肿瘤放疗领域又一新的研究热点。研究表明，一些circRNA可调控miRNA 的功能并作为miRNA 的海绵，在肿瘤的基因转录调控中发挥重要作用[4]。我们对circRNA 作为新型的肿瘤标志物及其在肿瘤放疗中应用的研究进展作一综述。

1 常见肿瘤的生物标志物circRNA

1.1 circRNA 与食管癌

食管癌是消化道常见的恶性肿瘤之一。虽然根治性食管癌切除术联合化疗已得到广泛的应用，但由于食管癌难以早期诊断且易发生转移，其5年总生存率仍然较低。因此，寻找新的生物标志物和治疗靶点是提高食管癌诊治水平的关键。有研究表明，食管鳞状细胞癌组织中circ_100876 和circ_0067934 的表达水平明显高于相应的非癌组织，而circ_0043898 在食管癌组织中的表达下调[5-7]。circ_100876 和circ_0067934 的下调可抑制食管鳞状细胞癌细胞的增殖、侵袭和转移，而过表达的circ_0043898 也可抑制癌细胞的发生发展，诱导癌细胞凋亡或死亡，这3 种circRNA 均可作为食管癌诊断和治疗的生物标志物。Rong 等[8]通过实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）检测结果发现，与正常样本相比，circ-DLG1（hsa_circ_0007203）在食管鳞状细胞癌的细胞、组织和血浆中的表达量明显上调。此外，上调的circ-DLG1 显著增加了细胞的增殖能力。进一步构建circ-DLG1 与miRNA 相互作用的网络，结果发现circ-DLG1 可以作为20 种miRNA 的海绵且具有60个相应的靶mRNA，因此circ-DLG1 可作为一种新型食管鳞状细胞癌的生物标志物发挥作用，但是circ-DLG1 是如何与其靶miRNA 及其相应的mRNA相互作用，从而影响肿瘤的发生发展还有待进一步的研究。

1.2 circRNA 与胃癌

胃癌是一种常见的消化系统恶性肿瘤，发病率居所有恶性肿瘤的第4 位，在东亚国家（如中国和日本）高发。胃癌的发生伴随着肿瘤细胞中一系列RNA和蛋白质的改变[9]，阐明胃癌发生发展的分子基础，可以确定其潜在的诊断标志物和治疗靶点。Sun等[10]研究发现，与对照组相比，hsa_circ_0000520在胃癌组织、血浆和胃癌细胞系中均显著下调（P=0.0374）。hsa_circ_0000520 的表达与胃癌关键临床指标有很强的相关性，如癌胚抗原（P=0.033）和TNM 分期（P=0.042）。他们在circinteractome 数据库上进行了circRNA-miRNA 相互作用网络的预测，得出9 个候选miRNA 及200 个相应的靶mRNA与circ_0000520 发生相互作用。其中miR-512-5p、miR-663b、miR-1258、miR-1233 和miR-129 参与抑制或促进胃癌的形成。Wang 等[11]发现，circ_0027599在胃癌组织中的表达明显下调。随后的生物信息学工具和荧光素酶报告基因检测结果发现，circ_0027599负向调控miR-101，在转染circ_0027599 小干扰RNA 的胃癌细胞中miR-101 水平上调，从而证明circ_0027599 为miR-101的海绵。此外，通过转染miR-101 抑制剂，胃癌细胞中circ_0027599 的表达上调，降低了胃癌细胞的增殖和转移能力，这说明circ_0027599 可通过与miR-101 的相互作用参与胃癌的发生发展。此外，也有研究表明，circ_0074362[12]、circ_0003159[13]和circ_0001895[14]在胃癌组织中的表达明显下调，并与一些临床指标，如肿瘤标志物和TNM 分期密切相关。circRNA可作为一种新型稳定的生物标志物，在胃癌的临床诊断和治疗中得到应用。

1.3 circRNA 与肺癌

肺癌是全世界范围内最常见，病死率最高的恶性肿瘤之一，其中80% 以上都是非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC），虽然规范化的诊断和治疗使肺癌的生存率稳步上升，但其5 年总体生存率依然低于20%。因此寻找肺癌新型的诊断和治疗标志物是当务之急[15]。Zong 等[16]通过qRT-PCR 检测57 例肺癌患者肺腺癌组织及癌旁组织中circ_102231 的表达，结果显示，circ_102231的表达明显上调（P＜0.05），且与整体生存率低、TNM晚期（Ⅲ～Ⅳ）和淋巴结转移密切相关（P＜0.05）。生物学功能研究结果显示，抑制circ_102231 的表达可抑制肺癌细胞的体外增殖、侵袭和转移。此外，通过ROC 曲线证实circ_102231 对肺癌具有良好的诊断价值，其灵敏度和特异度分别为81.2%和88.7%。Tian 等[17]发现，circABCB10 在NSCLC 细胞中的表达显著增加，生物信息学和荧光素酶活性报告分析证明circABCB10 是miR-1252 的海绵，且叉头盒R2（forkhead box 2，FOXR2）是miR-1252 的靶点。miR-1252 与FOXR2 的3'UTR 相互作用，并抑制FOXR2 的表达。此外，沉默circ_ABCB10 可抑制FOXR2 的表达，这提示circABCB10 可通过海绵作用调控miR-1252，从而增加FOXR2 的表达，进而促进NSCLC 的进展，所以circ_ABCB10 可能是NSCLC 潜在的治疗靶点。研究表明，circ_103809通过海绵化miR-4302 促进zinc finger protein 121的表达，提高肺癌细胞MYC 蛋白水平，进而促进肺癌细胞的增殖和侵袭；circ_0012673 通过miR-22/ErbB3 通路参与肺腺癌细胞的增殖；circMAN2B2可以作为miR-1275 的海绵，促进Forkhead box K1的表达，从而促进肺癌细胞的增殖和侵袭[18]，这说明circRNA 作为miRNA 的海绵可以调节miRNA下游的分子，从而在肺癌的发生发展中起重要作用。

1.4 circRNA 与肝细胞癌（ h epatocellular carcinoma，HCC）

HCC 是最常见的恶性肿瘤之一，虽然近年在手术技术和肝移植等方面取得了一定的进展，但HCC 患者的远期生存率仍较低。因此，探索新的生物标志物和治疗靶点对优化HCC 的治疗和预后至关重要[19]。Zhu等[20]在已知circ_0067934 的上调可以促进食管鳞状细胞癌细胞增殖[6]的基础上，利用qRT-PCR技术进一步发现circ_0067934 在HCC组织和细胞中的表达也明显上调，且circ_0067934的表达与TNM 分期和HCC 的进展呈正相关。通过生物信息学和荧光素酶活性报告分析，结果发现并验证了circ_0067934 是miR-1324 的海绵。miR-1324 在HCC 细胞中靶向结合Frizzled 5（FZD5）mRNA 的 3'UTR 区。FZD5 是Wnt 的共受体，可以促进Wnt/β-catenin 信号通路的激活。因此，circ_0067934/ miR-1324/FZD5 / Wnt/β-catenin 轴是一个有前景的HCC 治疗靶点。Weng 等[21]结合基因芯片和qRT-PCR 技术，在肿瘤浸润淋巴细胞高的HCC 患者中识别出6 种差异表达的新型circRNA。Kaplan-Meier 生存曲线显示，circ_0064428 的表达与HCC 患者的生存高度相关。circ_0064428 的表达在肿瘤浸润淋巴细胞高的HCC 患者中明显下调，且与患者的总生存率、肿瘤大小和转移负相关。此外研究还发现，与传统的HCC 预后标志物甲胎蛋白相比，circ_0064428 作为独立的HCC 预后生物标志物具有无可比拟的优势。此外，近年的研究表明，circ_0004018、circ_0003570 和circ_0005075等 circRNA 极其稳定并高度保守，表达模式具有组织特异性[22]，是诊断HCC 的潜在生物标志物，但仍需要更多的研究来阐明这些circRNA 在HCC中的分子生物学机制。

1.5 circRNA 与宫颈癌

宫颈癌是世界范围内女性的第2 大常见肿瘤，也是女性癌症相关死亡的主要原因。虽有证据表明感染高危型人乳头瘤病毒（HR HPV）会大大增加宫颈癌的发病率，但宫颈癌的发病机制尚不明确。因此，寻找新的诊断和预后生物标志物对宫颈癌的治疗至关重要[23-24]。Song 等[25]分析了GSE102686 数据库中差异表达的circRNA，结果发现circ_101996在宫颈癌组织中明显高表达，并促进宫颈癌的增殖、侵袭和转移，被认为是宫颈癌的致癌基因。他们通过荧光素酶活性检测进一步证实了circ_101996是miR-8075 的海绵，miR-8075 与xKlp 靶蛋白2（targeting protein for xenopus kinesin-like protein 2，TPX2）结合抑制了TPX2 的表达，并且既往研究表明，TPX2 可促进宫颈癌的进展[26-27]。circ_101996通过海绵作用调节miR-8075 导致TPX2 过表达，从而促进宫颈癌的进展，这提示circ_101996-miR-8075-TPX2 功能网络有助于宫颈癌进展机制的研究。近年的研究结果发现，circ_0067934/miR-545/EIF3C 轴[24]、 circ_0023404/miR-136/TFCP2/YAP 轴[28]和circ_8924-miR-518d-5p/519-5p-CBX8 轴[29]等促进了宫颈癌的进展，为宫颈癌分子水平的治疗提供了一个全新的视角，并可能成为宫颈癌治疗的潜在靶点。

总之，随着高通量RNA 测序和生物信息学技术的发展，circRNA 在越来越多的肿瘤中被发现，circRNA 的保守性、稳定性和组织特异性等特点及其在肿瘤细胞中的差异性表达使其在作为肿瘤早期诊断、治疗和预后的生物标志物上具有巨大的临床应用潜力。此外，circRNA 可作为 miRNA 的海绵，通过与肿瘤相关的miRNA 或信号通路的相互作用，对肿瘤的发生发展起重要的调节作用。虽然circRNA 的研究尚处于起步阶段，但其独特的结构与功能预示着circRNA 可能成为有前景的肿瘤生物学标志物，并为肿瘤个性化治疗提供重要的研究思路和新的治疗靶点。

2 circRNA 与肿瘤放疗

放疗是通过电离辐射促进肿瘤细胞DNA 损伤、抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡，同时可调控肿瘤细胞内多条信号通路[30]，从而达到杀伤肿瘤的目的。但肿瘤细胞的放疗抵抗一直是影响放疗疗效的巨大难题。近年的研究结果表明，照射后circRNA的表达出现了不同程度的上调或下调，circRNA 在肿瘤细胞中的差异性表达与肿瘤的放疗抵抗密切相关，可能成为提高放疗疗效的分子靶点[31-32]。

O′Leary 等[33]利用基因芯片和二代测序技术得出，人内皮细胞外泌体中由含WW 域的氧化还原酶编码的circRNA KIRKOS-71 和KIRKOS-73 在受到中、低剂量照射后，对电离辐射产生不同程度的应答，并在不同细胞系中差异性表达。如在使用0.25 Gy 和2.5 Gy 照射24 h 后的神经母细胞瘤细胞系SHEP 中，circRNA KIRKOS-71 和KIRKOS-73 的表达均下调。相比之下，在骨肉瘤细胞系U2OS 中，低剂量照射24 h 和中等剂量照射4 h 后，二者的表达均显著上调。circRNA KIRKOS-71 和KIRKOS-73作为稳定分泌的circRNA 参与细胞辐照反应，可为寻找放疗的生物学标志物提供新的思路。

Yu 等[31]对circRNA 在宫颈癌HeLa 细胞系中的辐射抵抗作用进行分析，采用高通量测序技术对HeLa 细胞中16 893 种circRNA 进行检测，结果发现，与对照组相比，照射组中差异表达的circRNA 共153 种，其中76 种上调、77 种下调。京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析显示，丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK）信号通路是circRNA 最丰富的通路，有19 个相关基因。此外，在MAPK 和神经营养蛋白信号通路中均发现6 种基因：RPS6KA5、RPS6KA6、CRKL、RAP1A、FASLG 和MAPK8。蛋白互作网络分析显示，MAPK8 蛋白是与其他10种蛋白相关的中心蛋白，对MAPK8 编码基因的研究结果表明，其在T 细胞增殖、凋亡和分化过程中发挥关键作用，可能是宫颈癌放疗抵抗的关键蛋白。以上研究结果提示circRNA 在宫颈癌的放疗中存在差异性表达，并且在放疗抵抗中起重要作用。但circRNA 引起HeLa细胞辐射抗性的分子生物学机制需要进一步探讨。

Shuai 等[34]对不同亚型的circHIPK3（circ_100783、circ_0000285 和circ_100782）在鼻咽癌患者中的表达水平进行检测， 利用qRT-PCR 技术检测到circ_000285在鼻咽癌患者组织和血清中的表达显著上调，且放疗抵抗患者circ_000285 的表达水平较放疗敏感患者升高3 倍，Kaplan Meier 生存曲线显示，circ_000285高表达患者的总生存率明显低于circ_000285 低表达患者，这提示circ_000285 可作为鼻咽癌诊断、预后和预测放疗疗效的生物学标志物。

Su 等[32]对放疗抵抗食管癌患者的细胞样本进行基因芯片分析，在检测到的3752 个候选circRNA中，与亲本细胞系KYSE-150 相比，人耐辐射食管癌细胞系KYSE-150R 中有57 种circRNA 的表达上调、17 种下调。其中circ_100385、circ_104983和circ_001059 呈显著性高表达，同时circ_101877、circ_102913 和 circ_000695 的表达水平则明显下降，这提示circRNA 表达水平的改变参与了食管癌放疗抵抗的调控。他们在circRNA/miRNA 共表达网络中发现，circ_001059 和circ_000167 是两个最重要的节点，它们作为miRNA 海绵，可能参与放疗抵抗的形成。此外，在KEGG 通路富集分析中，与上调circRNA 相关的磷脂酰肌醇信号通路已被证实为肿瘤细胞对辐射反应的核心媒介，磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/Akt 通路通过加速DNA 双链断裂的修复导致放疗抵抗[35]。同时，与下调circRNA相关的Wnt 信号通路也在胶质母细胞瘤[36]和前列腺癌[37]的放疗抵抗中发挥重要作用。但这些通路是否参与食管癌的放疗抵抗仍需进一步研究。此研究为circRNA 在放疗抵抗中的分子机制的研究提供了新的思路。

此外，circRNA 的差异性表达与放疗后的不良反应密切相关。如由于食管上皮细胞对电离辐射极为敏感[38]，颈部、胸部或纵隔区域肿瘤患者在接受放疗的过程中容易发生放射性食管损伤。Luo 等[39]对circRNA 在大鼠辐射诱导食管损伤模型中的生物学功能进行KEGG 通路富集分析，结果表明，在照射过程中，circRNA 的差异性表达与鞘脂代谢密切相关，鞘脂代谢可能是辐射诱导食管损伤的重要环节，这提示鞘脂代谢可作为一种药物靶点，可用于减轻放疗后食管损伤的不良反应，提高放疗的疗效。又如肠道上皮细胞的辐射耐受性低，腹部或盆腔肿瘤放疗后可产生高辐射毒性，从而导致辐射诱导的肠道损伤。Lu 等[40]发现辐照后小鼠空肠细胞中90 个circRNA 发生差异性表达，其中42 个上调、48 个下调。通过基因本体生物过程富集和KEGG 通路富集分析，结果表明，14 个上调的circRNA 的靶向mRNA 也上调， 22 个下调的circRNA的靶向mRNA 也下调，且发现一个circRNA 可以与多个miRNA 相互作用，一个miRNA 又可以抑制多个mRNA。由于目前还没有公认的预防和（或）治疗放射性肠损伤的方法，circRNA-miRNAmRNA 网络为circRNA 在辐射诱导的肠道损伤和修复中的研究提供了新思路。但寻找可应用于减轻放疗对肠道损伤的特定circRNA仍需进一步的深入研究。

3 circRNA 在肿瘤放疗中的前景展望

在当代肿瘤治疗的三大手段中，由于肿瘤细胞对化疗药物易产生耐药性、手术治疗的局限性以及许多患者在确诊时已为肿瘤晚期，失去了最佳的手术时机，因此，放疗在肿瘤综合治疗中的地位越来越突显。但放疗抵抗是目前影响肿瘤患者放疗疗效的关键问题。尽管同步放化疗以及使用放疗增敏剂等方法在不断地创新与完善，但其特异度与灵敏度低，无法克服放疗后不良反应等问题一直难以攻克，所以寻找新型克服放疗抵抗的分子靶点是当前的研究热点。

随着RNA 测序和基因芯片等技术的飞速发展，越来越多的研究表明circRNA 与许多疾病（尤其是肿瘤）存在着较为密切的关系。circRNA 的特殊结构赋予了其高度保守、特异性和稳定性高的特性，在血清中的高表达更是让circRNA 适用于临床检测。circRNA 在受到照射后肿瘤细胞中的差异性表达是其能够成为放疗生物标志物的基础，并且其与肿瘤的大小、分期、发生发展、侵袭和转移等具有相关性，因此有望成为评估放疗疗效和预后的关键指标。有文献报道，circRNA 可作为miRNA的海绵影响miRNA 作为翻译抑制因子的转录后作用[41]。又因为不同的miRNA 对放疗有不同程度的促进或抑制，所以我们大胆猜测可以通过circRNA靶向海绵化与肿瘤放疗抵抗相关的miRNA 并调控其下游信号通路，或抑制靶向海绵化与提高肿瘤放疗敏感性相关miRNA 的circRNA，从而达到提高放疗疗效的目的。总而言之，靶向调控circRNAmiRNA 网络可能为增强肿瘤放疗敏感性提供新的思路，从而针对不同肿瘤和不同个体进行更加有效的个性化治疗。

4 小结与展望

综上所述，circRNA 作为新型提高放疗敏感性的肿瘤标志物具有良好的前景和应用价值，但对于circRNA 在放疗抵抗中发挥的分子生物学机制以及和放疗抵抗相关的特定circRNA-miRNA 调控网络与其下游信号通路还需要更多的研究进行突破。相信随着研究手段的不断进步，会有越来越多的circRNA 作为放疗敏感性的开关分子在临床上得到广泛应用。

利益冲突本研究由署名作者按以下贡献声明独立展开，不涉及任何利益冲突。

作者贡献声明郭新园负责综述的选题、文献的搜集与整理、综述的撰写；王蕊负责文献的检索与综述的修改；衣峻萱负责综述的修改与校对；金顺子负责综述的思路确定和指导。