RNA IncWDR 26表达水平与肝癌患者疾病进展和预后的相关性*

陈宝胜 刘雅刚 张吉水 宋 哲

河北省沧州市中心医院普通外二科 061000

我国是肝癌大国，每年发病率及死亡率约占全球总数的一半[1]，当前肝脏切除术仍是治疗肝癌的首选方案，治疗后5年生存率约为30%[2]，预后普遍较差，因此探究肝癌发生机制及新的预后指标对于肝癌患者治疗及改善生存具有重要意义。有研究显示长链非编码RNA(Long chain non-coding RNA，IncRNA)在肝细胞癌中表达异常[3]，同时IncRNA也被证实是肝癌发生及进展的关键因素，其主要通过修改染色体结构及调控基因的表达进而发挥作用[4]，当前已识别多种IncRNA与肝癌的关系[5-6]，但仍有很多IncRNA与肝癌的关系尚未明确，其中IncRNA WD repeat domain 26(IncWDR26)，基因序列(RP11-36-5O16)，虽与其他恶性肿瘤有显著相关性[7]，但与肝癌患者疾病进展及预后的关系尚无相关报道，为此，本研究主要探究上述关系，现汇报如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2016年1月—2017年1月在我院诊断及治疗的肝癌患者，纳入标准：(1)肝癌诊断明确，符合中国抗癌协会肝癌专业委员会《原发性肝癌规范化病理诊断指南(2015版)》[8]；(2)手术适应证明确，符合《原发性肝癌诊疗规范》[9]，手术过程顺利且达到根治性切除标准；(3)年龄<75岁；(4)治疗依从性好，可接受长期随访。排除标准：(1)既往或存在其他恶性肿瘤；(2)伴有肝脏发育异常或其他疾病及治疗史；(3)已丧失手术机会使用放疗或化疗患者。共纳入142例患者，根据IncWDR26表达水平分为高水平组(71例)及低水平组(71例)。本研究已告知患者并签署知情同意书。

1.2 IncWDR26的检测

1.2.1 组织收集：所有患者肝癌组织及非癌组织于手术中收集并经病理切片证实，置于-80℃冰箱保存。

1.2.2 总RNA提取：使用总RNA提取试剂盒(购自Thermo Fisher Scientifc公司)进行提取，提取后置于-80℃冰箱保存。

1.2.3 qRT-PCR检测：设计合成相应的引物，分别用来扩增IncRNA，取上述1μg总RNA，根据 PrimeScript RT reagent kit 试剂盒(购自TaKaRa公司)说明书进行反转录，使用Step-One Plus Detection System(美国Applied Biosystems公司)进行qRT-PCR检测，甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)作为内参对照，定量测量使用2-ΔΔCt方式，引物如下：GAPDH-F：5’-GATTCCACCCATGHCCAAATTC-3’，GAPDH-R：5’-CTGGAAGATGGTGATGGGATT-3’；IncWDR26-F：5’-AGACCTGACCTGGAATGAGA-3’，IncWDR26-R：5’-TGGGCAACAGAGCAAGATT-3’；WDR26-F：5’-CATGGAAGGAGACTGGGATAAG-3’，WDR26-R：5’-GATTTCAAGTGCGCCTCTTAC-3’。

1.3 评价指标 对比两组一般资料，包括：性别、年龄、肿瘤直径、巴塞罗那分期(Barcelona Clinic Liver Cancer，BCLC)分期、术前甲胎蛋白(Alpha-fetoprotein，AFP)水平、手术方式及术后并发症发生情况。同时比较两组总生存期(Overall survival，OS)、无事件生存(Event free survival，EFS)情况，OS定义为：患者从开始治疗至死亡或随访截止的时间。EFS定义为：从入组开始到发生任何肝癌进展事件的时间，进展事件包括肝癌复发、再次手术、改为化疗、加用其他治疗、发生致死性或不能耐受的副作用。

1.4 随访 两组患者每2个月于门诊进行随访，检查项目包括：CT/MRI、血清AFP，对于可疑复发者进一步检查DSA或穿刺活检确诊，并根据检查结果选择二次手术、射频消融、肝动脉化学栓塞等治疗，预计随访时间24个月，随访截止日期2019年1月1日。

2 结果

2.1 患者IncWDR 26表达情况 142例患者肿瘤组织中平均IncWDR 26水平为0.12±0.47(log10)，非肿瘤组织中平均IncWDR 26水平为0.21±0.51(log10)，肿瘤组织显著低于非肿瘤组织(t=3.093，P=0.002)，以肿瘤组织IncWDR 26水平中位数0.13将所有患者分为高水平组(71例)及低水平组(71例)。

2.2 两组患者一般资料情况 高水平组在肿瘤直径≤5cm、BLCL分期A期人数比例显著高于低水平组(P均<0.05)，详见表1。

表1 两组患者一般资料比较[n(%)]

注：a表示t检验；b表示χ2检验；c表示Fisher确切概率法；d表示秩和检验。

2.3 两组患者进展情况 本研究中患者随访时间为8～24个月，中位随访 18个月，高水平组有3例失访，低水平组有2例失访。截止末次随访，高水平、低水平组中位EFS时间分别为23(16～24)个月、18(16～24)个月，高水平组疾病进展风险显著低于低水平组(HR=0.645,95%CI:0.418～0.996,P=0.036)。详见图1。

2.4 两组患者总生存情况 高水平组未达中位OS时间，低水平组中位OS时间为22(18～24)个月，高水平组死亡风险显著低于低水平组(HR=0.509,95%CI:0.310～0.834,P=0.006)。详见图2。

3 讨论

肝癌术后复发率较高，是影响患者预后的主要因素[10]，当前已明确的复发因素包括：肿瘤包膜侵犯、血管侵犯进而导致手术前患者肝内已存在微小转移灶或残余肿瘤[11]，但其发生的分子机制尚不明确。IncRNA是一类长度>200个核苷酸，且不具有编码功能的RNA片段，以往认为其无明显生物学作用[12]，但当前研究已证实多种IncRNA在恶性肿瘤的发生及进展中具有重要作用，并与肝癌及治疗后病情进展具有显著联系，而目前IncWDR26与手术后肝癌患者疾病进展及预后的关系尚不明确。

图1 两组无进展生存情况

图2 两组总生存情况

本研究结果显示患者肿瘤组织中IncWDR 26水平显著低于非肿瘤组织，表明IncWDR 26在肝癌的发生过程中具有一定作用。IncRNA主要作用是调节靶基因的表达，IncWDR 26已被证实可与转录因子(SIX3)发生相互作用，使SIX3与WDR 26启动序列结合，减少细胞内SIX水平并同时抑制WDR 26的转录，而SIX3是多种恶性肿瘤的抑制剂，其通过下调多种致癌基因(AURKA/B、S100P、TGFB3、GINS3)的表达而发挥抑癌作用[13]，因此IncWDR 26水平降低可能参与了肝癌的发生过程，Chen[14]研究也显示IncWDR 26可通过SIX3进而抑制肝细胞癌的生长和转移。

本研究结果还显示，高水平组在肿瘤直径≤5cm、BLCL分期A期人数比例显著高于低水平组，表明高水平IncWDR 26肿瘤病情显著优于低水平。肿瘤直径及BLCL分期与肝癌预后有显著联系，肿瘤直径越小、肝功能分期越好其预后情况也越好[15]，WDR 26属于WD重复蛋白家族，此家族中多种蛋白均参与了细胞多项活动，包括：细胞周期进展，信号转导，凋亡和基因调节[16]，同时研究证实WDR 26抑制丝裂原活化蛋白激酶通路[17]，并促进细胞增殖、迁移和侵袭[18]，且在肝细胞癌中IncWDR 26与WDR 26水平呈显著负相关[14]，这可能是高水平IncWDR 26抑制肿瘤生长及转移的机制之一。

同时本研究随访结果显示，高水平组疾病进展风险与死亡风险均显著低于低水平组，表明高水平IncWDR 26可有效提高患者预后。肝癌术后进展是影响治疗效果的主要因素，同时提高生存时间对于肝癌患者具有重要意义，由于IncWDR 26可通过SIX3及调节细胞增殖进而发挥抑癌作用，因此可有效提高肝癌患者EFS及OS，并也可作为肝癌患者术后独立预测因子，对制定治疗策略起到重要作用，同时也为肝癌的治疗提供了新的方向。

综上所述，IncWDR 26表达水平与肝癌患者疾病进展及预后有显著联系，水平越高预后越好。