凤尾草及其复方制剂体外抑菌效果的研究

韦清慧，南苹瑶，王立琦，鲍光明，王小莺

（1.江西农业大学动物科技学院，江西南昌330045;2.江西农大兽药研究所，江西南昌330045）

由于滥用抗生素造成病菌产生耐药性，国家农业农村部发布限抗、禁抗[1]，许多养殖公司正在寻求抗生素替代品，因此中草药作为预防畜禽疾病的保健药愈来愈受到大家的关注。 凤尾草性寒、味淡、微苦，归心、肝、大肠，具有清热利湿、解毒止痢、 凉血止血功效，临床用于治疗痢疾、黄疸、淋浊、泄泻、吐血、便血、尿血、湿疹等。 本课题将凤尾草与其他中草药科学配伍成复方Ⅰ、复方Ⅱ，并对5 种常见菌进行体外抑菌试验，为后期临床用药提供实验依据。

1 材料

1.1 药材 单方凤尾草：凤尾草全珠；复方Ⅰ（由凤尾草、乌梅、甘草等组成）、复方Ⅱ（由凤尾草、熟地、当归等组成）组分内各中药粉末。 凤尾草采摘于江西省南昌市梅岭风景区，其他中草药购于南昌市益丰大药店下罗分店。

1.2 菌种 标准菌株：大肠杆菌ATCC25922，购于广东省微生物菌种保藏中心；大肠杆菌K88、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、绿脓杆菌，由江西农业大学动物科学技术学院动物药学实验室保存。

1.3 主要试剂 营养琼脂培养基、 麦康凯培养基、LB 肉汤、MH 肉汤由北京奥博星生物技术有限公司生产，无水乙醇、二甲基亚砜由西陇科学股份有限公司生产。

1.4 主要仪器 中草药粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司），旋转蒸发仪、低温冷却液循环泵和循环水式多用真空泵（上海比朗仪器制造有限公司），立式压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂）,双人单面净化工作台（苏州净化设备有限公司），生化培养箱（韶关市泰宏医疗器械有限公司），恒温培养摇床（上海苏坤实业有限公司）。

2 方法

2.1 培养基制备 营养琼脂培养基、麦康凯培养基、MH 肉汤、LB 肉汤，按照培养基说明书，称量，溶解，分装，高压灭菌的步骤方法准备以上培养基。

2.2 菌液制备 菌株复壮：将冷冻保存的菌株解冻溶解至室温，倒入LB 肉汤中，37℃、220r/min恒温摇床中培养4-6h，取50μL 菌液于普通琼脂培养基上用接种环划线接种，在37℃生化培养箱培养18～24h。 菌株纯化培养：挑选单一菌落于麦康凯培养基上划线接种，在37℃生化培养箱培养18～24h。

菌液准备：从麦康凯上挑选单一菌落，接种于LB 肉汤中，37℃、220r/min 恒温摇床培养6h。用紫外分光光度计计数法计算菌液浓度，并将菌液浓度调制1.5×106CFU·mL-1，放入冰箱4℃冷藏备用。

2.3 药液制备 采摘新鲜的凤尾草全株，冲洗干净，烘干。 将凤尾草及其他中药按比例称重混合放入粉碎机粉碎成粉末。

分别称取凤尾草粉末20g、复方Ⅰ18g、复方Ⅱ18g，用滤纸包成长条，塞入圆底烧瓶，按照1：20 固液比加入70%乙醇溶液浸没药包，常温浸泡30min 后50℃回流提取1h，提取两次。 合并提取液，58℃80r/min 转速下旋蒸浓缩，干燥，干燥物即为药膏，记下质量。 临用前用2mL 二甲基亚砜加入药膏中，放入超声波中加速溶解，待溶解后加入8mL 的无菌蒸馏水，放入冰箱4℃冷藏备用[2]。

2.4 体外抑菌试验 依据CLSI 推荐的微量二倍稀释法进行测定，准备好无菌的96 孔板，高压灭菌的MH 肉汤依次准确地加入96 孔板中[3]，试验组每行的第一孔加入100μL 药液后用移液枪充分吹打混匀，然后移取100μL 加入第二孔再充分吹打混匀，照此重复至最后一孔，第12 孔吸出100μL 弃掉； 试验组每个孔加入50μL 菌液，重复三行，另设药液对照管、菌液对照管和肉汤空白对照管。 放入37℃恒温培养箱培养18～24h。

3 结果与分析

体外抑菌试验结果见表1。从表1可知，复方Ⅰ的最低抑菌浓度较凤尾草、复方Ⅱ的低，表明复方Ⅰ对5 种细菌的抑制效果优于单方凤尾草、复方Ⅱ；复方Ⅱ对K88、沙门氏菌的体外抑菌浓度与复方Ⅰ相似，对金黄色葡萄球菌、ATCC25922 和绿脓杆菌的体外抑菌活性也很强，但不如复方Ⅰ；单方凤尾草体外抑菌浓度不如复方Ⅰ、复方Ⅱ，对k88 和金黄色葡萄球菌未测得抑菌浓度。

表1 最小抑菌浓度测定结果

4 讨论

本实验研究表明，凤尾草单方对3 种受试菌有很好的体外抑菌活性，但其对受试菌的MIC 还是不如复方Ⅰ、复方Ⅱ。 有学者研究发现，凤尾草对金黄色葡萄球菌有很好的抑制作用[2]，但本课题研究中未测得对金黄色葡萄球菌最低抑菌浓度。从总体上看，三种配方对ATCC25922、沙门氏菌、绿脓杆菌都有抑菌作用，尤其是复方Ⅰ。

影响三种药方体外抑菌试验测定结果因素主要两个。 第一，DMSO 溶解展开的存在差异性，复方凤尾草的溶解性比单方凤尾草好，在DMSO原液溶解加入适量水后复方Ⅰ和复方Ⅱ溶解性依旧很好，而单方凤尾草有呈现析出颗粒现象，因此药膏溶解性对细菌的抑制作用产生一定的影响。 第二，药液色素存在的影响，单方凤尾草为草绿色，复方Ⅰ和复方Ⅱ为棕红色，药液色素对细菌浑浊度的判断有影响。