质谱技术在缺血性中风标志物发现中的应用及进展

王健莹，吴 茜，姚钟平*

(1.香港理工大学 化学生物学及药物研发国家重点实验室，食物安全及科技研究中心，应用生物与化学科技学系，香港；2.香港理工大学深圳研究院 深圳市中药药学及分子药理学研究重点实验室(国家重点实验室培育基地)，深圳市食品生物污染与控制重点实验室，广东 深圳 518057)

脑卒中是严重威胁人类健康的重要疾病，具有高致残率和高死亡率的特点。脑卒中包括出血性中风(ICH)和缺血性中风(IS)，其中，IS占比高达87%[1-2]。根据发病原因，IS又分为大动脉粥样硬化性卒中、小动脉卒中、心源性脑栓塞以及未知病因IS。组织性纤溶酶原激活剂(rtPA)是目前美国食品药品监督管理局(FDA)批准的唯一用于急性IS溶栓的药物，然而静脉注射rtPA的最佳治疗窗为发病后3 或 4.5 h内，一旦错过该黄金时间，不仅预后不佳，而且出血性转化的概率大幅提高[2]。所以，IS的早期预防、诊断、治疗以及预后的功能评估成为降低IS致死率和致残率的关键。目前，脑梗死的诊断主要依据临床表现及神经影像技术，辅以神经血管成像数据或计算机断层扫描(CT)、磁共振成像(MRI)、超声检查或血管造影。这些成像技术已被用于区分缺血性和出血性中风，并排除卒中假象。对于急性缺血性卒中诊断，目前这些临床常用方法因在灵敏度、准确度及耗时方面尚存在不足[3]，有时会产生误诊或者漏诊，从而可能导致治疗延误及增加复发中风的风险。寻找分子标志物以快速且准确诊断和区分缺血性中风，是解决这些问题的有效方法。

质谱技术不仅灵敏度高、分析速度快、无需标记、可同时检测多组分，还能获得分子的结构信息，在组学领域已逐渐成为主要分析手段。液相色谱-质谱和气相色谱-质谱联用技术可以在质谱分析前进行色谱分离，有助于生物样本中复杂成分的结构鉴定和定量分析，因此广泛应用于标志物的发现[4]。此外，基质辅助激光解吸电离(MALDI)飞行时间质谱成像技术可直接分析生物组织切片样本，对组织中化合物的组成、相对丰度及分布情况进行高通量、全面、快速分析，在生物标志物的发现中具有广泛的应用。近年来，质谱技术被越来越多的学者用以进行脑梗死相关标志物的发现，在脑梗死的超早期诊断、病因学分型、预后评估、鉴别诊断以及二级预防等方面发挥着越来越重要的作用。与IS相关的分子标志物主要为蛋白质以及小分子代谢物，以下将对质谱技术在这两类标志物发现中的应用进行综述及展望。

1 蛋白质标志物

脑损伤发生后的脑细胞状态与蛋白质表达密切相关，因此蛋白质标志物筛选对中风的快速诊治有着积极、重要的作用，并且有些已经进入临床实验[5-7]。近年来高通量的蛋白质组学技术在评估神经元损伤程度，研究药物作用机制以及寻找关键蛋白标志物等方面的作用日益明显[7]。基于质谱分析的蛋白组学使得获得高精度的大量谱学数据成为可能，在中风标志物发现方面有不可替代的优势。

1.1 缺血性中风标志物

与脑组织、脑脊液相比，血液或者血浆样品中标志物含量相对较低，但是因为侵入性小，容易获取，并且直接与循环系统相关联而在临床上有着重要的价值[7]。而血液标志物在中风的诊断、预测中风后脑损伤程度、中风复发以及愈后恢复进展等方面都有一定相关性[9-10]。Allard等[11]将表面增强激光解析(SELDI)技术应用于中风标志物研究，实验组血浆样品强阴离子交换SELDI谱显示4种蛋白可以作为潜在的标志物，分别为载脂蛋白C1(ApoC-I)、载脂蛋白C-3(ApoC-Ⅲ)、血清淀粉样蛋白与抗凝血酶Ⅲ(AT-Ⅲ)，并通过酶联免疫吸附试验(ELISA)分析首次发现ApoC-I与ApoC-Ⅲ蛋白在缺血性中风与出血性中风患者间有显著性差异。类似地，Lopez等[12]进一步以选择离子监测(SIM)质谱分析方法对临床患者血浆样本中一组9个载脂蛋白进行定量分析，研究结果表明，结合ApoC-Ⅲ与ApoC-I两种蛋白血浆浓度值，可以很好地鉴定缺血性中风与出血性中风，为之前研究结果提供了很好的验证。George等[13]专注于短暂性脑缺血发作(TIA)的研究，以高分辨线性轨道阱质谱对TIA患者、小中风患者与对照组别的血清蛋白质组开展了分析，实验中血清铜蓝蛋白、补体成分8γ(C8γ)与血小板碱性蛋白在中风组与对照组间有显著性差异，其中，血小板碱性蛋白被验证可以列为TIA诊断的候选标志物。此外，在生物表型中有非常重要作用的金属蛋白标志物，亦具有区分中风类别的能力。Kodali等[14]以电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)检测不同中风类别的29个血浆样品，发现镁、锰、铜、硒相关的蛋白在类中风和缺血性中风，以及缺血性中风与出血性中风病人组间均有统计学差异；而铅浓度在类中风和缺血性中风病人中有组间差异。

文献[15]以质谱方法定量测定外周血单核细胞(PBMCs)中叠氮基丙氨酸标记的新生蛋白质组，结果发现新生蛋白和总蛋白组在中风组与正常对照组间均存在差异，而PBMC新生蛋白组改变更加明显，可作为新的中风标记物筛选来源。此外，脑组织和脑脊液样本可以直接针对中风发作前后的病灶部位、病程进展情况以及特定类别病例进行分析，其结果对于临床诊断具有更重要的意义。Garcia等[16]采用基于质谱的蛋白质组学方法，在患者中风后受损伤部位脑区组织中鉴定到51个蛋白水平发生了变化，其中凝溶胶蛋白、二氢嘧啶酶相关蛋白2与胱抑素3种蛋白分子与中风后遗情况密切相关。结合激光捕获微解剖技术，质谱技术可以实现对指定位点蛋白标记物的半定量测定。Lian等[17]发现在中脑动脉闭塞位点，包括轻肽神经丝蛋白(NEFL)、人互联蛋白神经元中间丝蛋白α(INA)、微管相关蛋白2(MAP2)、髓磷脂碱性蛋白(MBP)、髓鞘蛋白脂质蛋白(PLP)和2′,3′-环核苷酸3′-磷酸二酯酶(CNP)在内的6种非可溶蛋白分布较为集中，而神经元特异性烯醇化酶(NSE)、泛素羧基末端水解酶-1(UCH-L1)、神经丝重链多肽(NEFH)、神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、微管相关蛋白Tau蛋白与Ⅲ型β微管蛋白(TUBB3)在脑组织中则是均匀分布的，此结果表明非可溶性蛋白可以作为位点相关性的标志物，具有进一步临床研究潜力。同样地，对脑脊液中蛋白质组的分析有助于找到中枢神经系统相关的标志物，对脑部疾病有很好的诊断意义，因而吸引了不少研究关注[18-19]。Dayon等[20]采用异构体多级质谱标记(TMT)定量方法对严重脑损伤死亡患者(PM)与临死前患者(AM)脑脊液样本中蛋白组进行比较，结果显示PM组别样本中鉴定到的78个蛋白含量明显高于对照组，包括GFAP、S100B蛋白与帕金森氏病蛋白7等之前报道过的蛋白。

1.2 缺血性中风病因亚型标志物

卵圆孔未闭会导致血栓通过静脉进入动脉循环，引起中风，此类患者往往有较高中风风险，而血管内封闭是常用的治疗手段。白蛋白可以作为脂蛋白、小分子和药物等的载体，具有重要生物活性并受到广泛研究关注。为比较一般中风与卵圆孔未闭引起的中风组间，以及卵圆孔未闭中风患者与实施血管内封闭组别的差异，Lopze等[21-22]采用白蛋白免疫富集与高分辨多级质谱联用的方式，特异性捕获并定量血浆样本白蛋白相关的蛋白质组，发现白蛋白相关蛋白质组研究可以成为有力的标志物发现手段，血管内封闭可以对高密度脂蛋白胆固醇及载脂蛋白A1丰度产生影响，对心血管功能提供保护。Rocchiccioli等[23]发现动脉粥样硬化有较高的发病率和死亡率，而颈动脉斑块破裂导致的急性中风约占缺血性中风的15%～20%，与组织整体蛋白组相比，斑块分泌蛋白组学可以检测到更有代表性的标志物。以非标记高分辨质谱方法对14个病人颈动脉内膜剥离样本中的分泌蛋白组进行分析，发现血小板反应素-1、维生素D结合蛋白、黏着斑蛋白显示出异常水平，经抗体活性验证，前两种蛋白在动脉粥样硬化患者中有着明显高表达。MALDI质谱成像技术是测定物质组织分布的强有力手段，对中脑动脉封闭模型小鼠脑组织出现梗塞部位切片与对侧对照部位切片分别进行成像，发现13种物质含量在梗塞区域有显著升高，鉴定结果表明ATP合成酶5I、细胞色素C氧化酶亚基VIc和人尿苷酸-胞苷酸激酶3种蛋白表达有所改变[24]。

2 小分子代谢物标志物

代谢产物位于生命活动的下游，能直接地反映组织的生化状态。小分子代谢物比蛋白质更容易透过血脑屏障，而且与RNA和DNA比较，稳定性更好[25]，因此，代谢组学成为快速和全面分析卒中生物样本的强有力手段。作为代谢组学研究常用的技术平台，液相质谱和气相质谱结合了色谱良好的分离能力和质谱的高灵敏度及高分辨率，可用于量化和鉴定复杂生物医学样本中低浓度代谢物。因此，利用质谱和代谢组学方法检测患者代谢水平的差异，进而探索IS相关的生物标志物，可指导IS的预防、诊断和治疗过程，并揭示中风的生理病理途径。

2.1 缺血性中风标志物

Jiang等[26]利用UPLC-TOF MS分析了67名超急性卒中患者和62名健康受试者的血清样本，发现卒中患者体内半胱氨酸、S-腺苷同型半胱氨酸、氧化性谷胱甘肽、羟基二十碳四烯酸和羟基十八碳二烯酸的浓度升高，而叶酸、四氢叶酸、腺苷、醛固酮、去氧喋呤、蔗糖-6-磷酸和甜菜碱水平显著性降低，并建立了正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)模型预测中风的可能性。多项代谢组学研究表明，缺血性卒中患者血液中谷氨酸增加，赖氨酸、苏氨酸、甘氨酸、蛋氨酸和丝氨酸减少[27-30]。Kimberly等[27]通过靶向分析证实超急性中风患者血浆中缬氨酸以及其他支链氨基酸(亮氨酸和异亮氨酸)水平降低，且支链氨基酸血浆水平降低的幅度与卒中患者的梗死面积和临床残疾相关。另外，一项前瞻性研究表明，基线支链氨基酸增加会增加心血管疾病尤其是缺血性卒中的风险[31]。为了区分缺血性和出血性中风，Hu等[32]鉴定了缺血性(n=129)和出血性(n=73)中风的差异代谢物(如天冬酰胺、瓜氨酸、亮氨酸、脯氨酸、酪氨酸和缬氨酸)。

有学者对中国30岁至79岁中风患者(1 146例IS患者，1 138例ICH患者)进行巢式病例对照研究，探讨血浆代谢指标与发生缺血性中风和脑出血风险之间的关系，结果表明胆固醇与IS负相关，甘油三酯与IS正相关，但是与ICH无关[33]。已有研究采用脂质组学和代谢组学方法对脂质代谢物与缺血性卒中之间的关联进行评估。这些研究结果表明，脂质分子可能在缺血性卒中的病因学中扮演着双重角色，即有些脂类增加会导致中风风险增加，而有些脂类水平提高使中风风险降低。具体而言，神经酰胺、二酰基甘油、二十二碳三烯酸、羟基二十碳四烯酸、羟基十八碳二烯酸、溶血磷脂酰胆碱(LPC)和三酰基甘油似乎增加了缺血性中风的风险[26,29,34-35]。在缺血性中风患者中，不饱和脂肪酸侧链脂质、胆固醇、亚油酸、油酸、棕榈酸、硬脂酸、游离脂肪酸、葡糖神经酰胺、磷脂酰乙醇胺、植物鞘氨醇、二氢鞘氨醇和LPC含量减少[29,35-37]；LPC(16∶0)水平降低或者LPC(20∶4和20∶5)水平提高都会增加罹患缺血性卒中的风险[29,35,37]；而血浆LPC(16∶0和20∶4)联合其他指标(血压、临床特征、症状持续时间等)可用于预测卒中复发。代谢组学也被用于预测急性缺血性病变的神经影像学特征，共有211种代谢物与缺血性损伤体积相关，包括LPC(20∶4和22∶6)、次黄嘌呤/苏氨酸、亮氨酸和其他3种未知化合物[38]。有研究[39]采用非靶向脂质组学方法来区分症状性和无症状的颈动脉粥样硬化斑块，结果显示磷脂酰胆碱(16∶0/20∶4和16∶0/18∶1)、磷脂酰乙醇胺(18∶1/18∶0)、花生四烯酸和未鉴定的脂质代谢物在内的许多标志物能更好地预测中风风险。Mariona等[23]采用LC-MS对131例TIA患者的血浆样本进行代谢组学分析，结果显示LPC(16∶0)与中风复发显著相关，而且LPC(20∶4)也可以作为中风复发的标志物，这组新的标志物对中风复发的预测能力比传统的预测方法更准确。

2.2 缺血性中风病因分型标志物

虽然目前的诊断手段可以对大动脉粥样硬化、小动脉脑卒中和心源性脑栓塞进行诊断，仍然有约30%的患者出院时病因未明[40]。寻找IS分型相关的生物标志物，了解未明病因患者的发病原因，实施针对性的治疗和相应的二级预防措施，可以降低其中风复发率。在缺血性卒中病因分型标志物的检测研究中，Nelson等[41]使用液相色谱-质谱联用测定了367名急性卒中患者血浆样本中的144种代谢物，将心源性和非心源性样本进行比较，发现三羧酸代谢物琥珀酸、α-酮戊二酸和苹果酸与心源性IS相关。此外，通过二分法预测琥珀酸盐与卒中复发有关。Nielsen等[42]在小鼠永久性局灶性脑缺血2 h、24 h、5 d、7 d和20 d后，对小鼠脑切片进行质谱成像以了解脑部炎症发生过程中特征化合物的时空变化，结果发现双单酰甘油磷酸酯BMP(22∶6/22∶6)和N-酰基-磷脂酰乙醇胺可分别作为吞噬巨噬细胞/小胶质细胞和死亡神经元的潜在生物标志物。许多其他化合物被发现与缺血性中风亚型息息相关，比如二十二碳六烯酸(DHA)、15-脱氧-△12，14-前列腺素J2(15-d-PGJ2)、神经酰胺和氧化型磷脂与低风险动脉粥样硬化中风有关，二十二碳五烯酸(DPA)可以降低心源性IS的风险[43-44]，同型半胱氨酸等与腔隙性中风相关[45-48],但对于IS病因亚型标志物的研究仍然很有限。

3 总结与展望

基于质谱的各种方法已被应用于寻找缺血性中风标志物，并已发现了一些蛋白质和小分子标志物，主要有S100B、GFAP、UCH-L1、NSE、氨基酸、脂质[25,49-50]。这些标志物表达变化有可能可以用于诊断中风以及缺血性中风病因分型，但在样本收集、研究结果一致性方面尚需更多验证，而且在临床应用方面需要作进一步探究。此外，亦有研究指出单一标志物因其特异性和灵敏度的不足，在实际临床应用方面仍有局限性，而以一组标志物进行标志在临床上会更有效[51]，组学研究亦需要有更统一、标准的标志物筛选以及统计分析方法。在样本类型方面，有研究表明[52]外泌体是疾病阶段特异性信息的重要来源，而且可以透过血脑屏障，是中风标志物发现的有利样本来源。另外，随着质谱新技术的发展，直接分析质谱技术，如实时直接分析(Directanalysis in real time,DART)和解吸电喷雾电离(Desorption electrospray ionization,DESI)技术[53-54]，可以快速分析样本，在提高分析灵敏度和准确率的同时，缩短中风诊断时间，因此开发基于直接质谱的诊断方法显得尤为重要。