栀子不同生育期根际真菌群落结构的动态变化

2020-02-25李巧玲任明波胡开治

西南农业学报 2020年11期

李巧玲，韩凤, 2，肖忠，任明波，胡开治, 2

(1. 重庆市药物种植研究所，重庆南川 408435；2. 重庆市道地药材规范化生产工程技术研究中心，重庆南川 408435)

【研究意义】根际是作物与土壤生态系统之间的交互界面，是作物发生物质代谢与能量转化最活跃的部位之一[1]，大量微生物定殖于此并与植物根系及周边土壤发生密切的相互作用，对植物养分获取、生长发育等很重要[2]。真菌是微生物区系的重要成员，参与土壤中有机物的分解、代谢及转化等生化过程，也是土壤生态系统健康与否的重要指标[3]，在土壤生态系统中起着举足轻重的作用。【前人研究进展】近年来，对根际真菌群落结构和多样性的研究受到了研究者们的高度关注，已成为土壤微生物学及土壤生态学等领域研究的热点之一[4]。陈诚等对健康羊肚菌根际土、烂柄病发病子实体根际土及相同环境下未栽培羊肚菌土壤的真菌群落结构进行了研究，发现烂柄病的发生改变了土壤真菌群落结构，发病后根际优势真菌类群为拟青霉属(Paecilomyces)、木霉属(Trichoderma)、葡萄穗霉属(Stachybotrys)及枝顶孢属(Acremonium)等[5]。许自成等采用PCR-DGGE技术，对轮作、连作3年、连作6年烤烟根际土壤不同生育期真菌群落结构的变化趋势进行了研究，发现无论是轮作还是连作，烤烟生育中后期土壤真菌群落最为丰富，且连作明显改变了烤烟根际土壤的真菌群落结构，随着连作年限的增加影响越大[6]。【本研究切入点】这些研究将有助于人们进一步掌握不同植株根际微生物种群分布及其消长规律，从而有针对性地改善根际土壤理化性质，改良作物根际真菌群落结构，提高作物品质和产量。【拟解决的关键问题】鉴于此，本研究采用高通量测序技术，对不同生育期栀子根际土壤真菌群落的动态变化趋势进行分析，观察栀子生长过程中根际微生物环境的变化，为栀子的高效栽培、丰产优产和病害防控提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 根际土壤样品采集

采样地点位于重庆市南川区三泉镇沙子堡栀子栽培基地，土壤为沙壤土，pH值5.1，含有机质31.53 g/kg、碱解氮89.9 mg/kg、有效磷1.06 mg/kg、速效钾96.79 mg/kg。分别于栀子的花蕾期(M1)、盛花期(M2)、果实膨大期(M3)及盛果期(M4)的晴天上午10:00左右采集土样。采用五点“S”型取样法，随机选择长势一致的栀子，将其连同根部土壤一同拔出，抖去大的土块，用毛刷收集须根上的根际土。土样混匀后置于自封袋中，迅速带回实验室于-20 ℃保存备用。

1.2 土壤总DNA的提取及高通量测序

采用FastDNA SPIN Kit for Soil(MP Biomedicals，U.S.)提取土壤总DNA。利用0.8 %琼脂糖凝胶电泳和超微量核酸分光光度计检测DNA的浓度和纯度，保证样品DNA的A260/A280值在1.8～2.0。然后以提取的土壤基因组DNA为模板，分别采用引物ITS1F：5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'和ITS2：5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'扩增真菌ITS1区域。PCR扩增程序为：95 ℃ 5 min；95 ℃30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，循环35次；72 ℃10 min，扩增产物经1.8 %琼脂糖凝胶电泳检测后，利用AXYGEN公司的胶回收试剂盒对目标片段进行回收。回收产物送至北京百迈克生物科技有限公司，利用Illumina Hiseq 2500平台进行高通量测序。

1.3 序列处理与分析

对高通量测序得到的原始序列进行双端拼接、过滤和去除嵌合体，得到优化序列，同时对其质量和拼接的效果进行质控过滤；然后将优化序列在97 %的相似度水平下进行聚类、获得OTUs(operational taxonomic units)，并根据OTU的序列组成得到其物种分类。基于OTU分析结果，对样品在各个分类水平上进行分类学分析，获得各样品在门、纲、目、科、属、种分类学水平上的群落结构图、物种聚类热图、属分类学水平系统进化发生树及分类学树状图。最后通过Alpha多样性分析、Beta多样性分析、差异优势菌群等分析，评估栀子不同生育期根际真菌的群落结构和多样性差异，以期揭示不同生育期栀子根际真菌群落组成的动态变化。以上分析均在北京百迈克生物科技有限公司BMKCloud云平台网站(http://console.biocloud.net)上完成。

2 结果与分析

2.1 高通量测序数据及OTU数

从表1可见，4组样品测序共获得295 470条原始序列，原始序列经拼接、过滤后共产生278 109条有效序列，每个样品至少产生60 630条有效序列。对有效序列在97 %的相似度水平下进行聚类，获得每个时期样品的OTU数，栀子4个生育期的土壤样品共产生2073个OTU，其中，M1的OTU最多，为683个，M2的OTU最少，为414个。从图1可见，4个样本共有的OUT为238个，M1、M2、M3、M4特有的OTU分别为404、149、241、160个，其余OTU为样本两两共有。其中，M1样本中特有的OTU数目最多，预示着该时期根际土壤中存在较多的特有微生物种类；M1和M2共有的OTU数目最多，为680个，说明这两个时期土壤中共有的微生物类群最多。

表1 栀子各生育期根际土壤真菌的高通量测序数据及OTU量

图1 不同区组根际土壤真菌OTUs韦恩图Fig.1 OTUs Venn diagram of fungal community in different soil compartments

2.2 根际真菌群落组成分析

2.2.1 门水平不同时期栀子根际土壤真菌在门水平上排名前十的群落组成如图2所示，4组土壤样品中的优势菌群主要包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)和被孢霉门(Mortierellomycota)，但各菌群在每组样品中所占的比例稍有差异。其中，子囊菌门相对丰度最高，占4个时期样品中的比例分别为49.74 %、53.80 %、38.04 %和54.08 %；其次为担子菌门，比例分别为20.39 %、8.96 %、13.42 %和42.37 %；被孢霉门相对丰度依次为7.13 %、30.69 %、24.13 %、0.34 %；而其他菌类相对丰度较低，如球囊菌门(Glomeromycota)、壶菌门(Chytridiomycota)、隐真菌门(Rozellomycota)、油壶菌门(Olpidiomycota)等。不同时期栀子根际土壤真菌的群落组成及相对丰度有一定的差异，其中，M1样品物种组成最为丰富，在门水平上的

图2 栀子不同生育期土壤真菌的门水平群落结构及分布Fig.2 Structure and distribution of soil microbial community at phylum level at different growth stages of Gardenia

物种种类最多；被孢霉门在M1、M2和M3样品中占优势，在M4样品中则明显占劣势；担子菌门则在M4样品中占绝对优势。表明不同生育期栀子根际土壤真菌群落组成各不相同，子囊菌门、担子菌门和被孢霉门为三大优势菌群，三者丰度之和达78 %以上，而其它真菌类群为非优势菌群。

2.2.2 属水平由图3可以看出，4个时期栀子根际真菌群落在属水平上丰度较高的真菌主要有被孢霉属(Mortierella)、木霉属(Trichoderma)、乳菇属(Lactarius)、镰刀菌属(Fusarium)、青霉菌属(Penicillium)及枝孢菌属(Cladosporium)等。各样品的优势菌属(相对丰度>10 %)存在一定差异，如在M4样品中被孢霉属、轮枝菌属(Verticillium)和青霉属相对丰度较其余3个时期小(相对丰度不足1 %)，而木霉属和乳菇属的相对丰度则比其余3个时期大(相对丰度超过30 %)。

图3 栀子不同生育期土壤真菌的属水平群落结构及分布Fig.3 Structure and distribution of soil microbial community at genus level at different growth stages of Gardenia

2.3 不同生育期栀子根际优势真菌差异分析

以不同生育期栀子根际土壤真菌类群为对象，使用LEfSe分析栀子不同生育期根际真菌群落中主要差异物种(LDA Score预设值4.0，高于4.0视为有显著差异)，结果见图4。图中LDA Score的绝对值代表差异物种的影响大小，LDA值越大，代表菌群差异性越大。栀子在每个生育期根际土壤中均存在有统计学差异的物种，银耳纲(Tremellomycetes)、粪壳菌目(Sordariales)、Trimorphomycetaceae科等真菌群落在M1样品中丰度较高；丛赤壳科(Nectriaceae)和镰刀菌属(Fusarium)在M2样品中丰度较高；柔膜菌目(Helotiales)、锤舌菌纲(Leotiomycetes)和Plectosphaerellaceae科等在M3样品中存在丰富；而哈茨木霉(Trichoderma_virens)、红菇科(Russulaceae)、肉座菌目(Hypocreales)和乳菇属(Lactarius)等在M4样品中相对丰度较高。

图4 栀子根际土壤真菌LEfSe分析Fig.4 LEfSe analysis of rhizosphere fungi of Gardenia

2.4 优势菌群功能分析

对栀子不同生育期根际优势真菌及其功能进行统计(表2)。在栀子的4个生育期中，优势真菌主要集中在子囊菌门、半知菌门和担子菌门所属的多个纲、目、科中。每个时期样品中的优势菌属各不相同，其中，大孢圆孢霉属在M1样品中为优势菌群，镰刀菌属在M2样品中为优势菌属，柔膜菌目和Verticilliumleptobactrum在M3样品中为优势菌群，哈茨木霉、嗜热子囊菌属及Lactariushorakii在M4样品中为优势菌属。在栀子的不同生育期，均存在一些益生微生物，这些微生物的功能主要是促进土壤养分的转化、增强作物对病原微生物的抵抗力，或与植物共生、产生一些促进作物生长的调节剂；同时也存在一些有害微生物，这部分微生物可诱发作物发生病害。

表2 栀子根际优势菌群及其功能

2.5 多样性分析

2.5.1 Alpha多样性分析 Alpha多样性反映的是样品内物种丰度(richness)及物种多样性(diversity)，本实验使用Mothur(version v.1.30)软件，对样品Alpha多样性指数进行了评估。各样品在相似度为97 %水平下的稀释曲线见图5，每组样品稀释曲线逐渐趋于平缓，表明样品序列充分、取样合理，可以用于后续数据分析。从栀子不同生育期样品Alpha多样性指数分析结果(表3)可以看出，所有样品OTU覆盖率Coverage指数均高于99 %，说明样本中物种被测出的概率较高，本次测序结果能较真实地反映样本中微生物的存在情况。花蕾期ACE和chao1值最高，花蕾期和盛花期相近，开花过后逐渐降低，说明花蕾期土壤微生物的物种总数最多，随着栀子结果期的到来，物种变得越来越稀少。随着生育期的推进，Shannon指数在盛果期M1达到最大，Simpson指数最小，说明该时期土壤样品中的物种多样性最高。

表3 栀子不同生育期样品Alpha多样性指数分析

图5 相似度为97 %水平下各土壤样品的稀释曲线Fig.5 Rarefaction curves of each soil sample at cutoff level of 3 %

2.5.2 Beta多样性分析使用QIIME软件进行Beta多样性分析，比较不同生育期栀子根际真菌群落在物种多样性方面存在的相似程度。主坐标PCoA分析、非度量多维标定法(NMDS)分析分别见图6-a～b，由图可知，M1和M2期的样品在坐标图上的距离最近，均分布于同一象限内，说明这2个时期的样品相似性最高，土壤真菌群落结构最为相似。

图6 栀子不同生育期根际真菌的PCoA分析(a)和NMDS分析(b)Fig.6 PCoA analysis (a) and NMDS analysis (b) of rhizosphere fungi of Gardenia at different growth stages

采用非加权配对平均法(UPGMA)对样品进行属水平上的聚类，来判断不同生育期栀子根际土壤真菌群落组成的相似性。样品属水平的聚类树见图7，即总体可分为两类，M1、M2和M3样品聚为一类，M4样品单独聚为一类，且M1和M2样品最为靠近，枝长最短，说明这两个时期样品的物种组成最相似。

图7 根际土壤真菌属水平的UPGMA聚类分析Fig.7 UPGMA cluster analysis of soil rhizosphere fungal

3 讨论

微生物在土壤生态系统占有重要地位，其多样性是表征土壤群落结构稳定性的重要因子。微生物多样性受植被、地理位置、土壤层次、土壤肥力、土壤类型及气候变化等因素影响[15]，同时土壤微生物多样性在土壤生态系统的结构、功能中起着重要作用。而真菌作为土壤中的一类真核微生物，其种类繁多、分布广泛，且参与土壤有机质的分解，能够为作物生长提供必须的养分，因此，土壤环境中真菌群落结构的变化对土壤质量具有重要影响。本研究借助高通量测序技术，对不同生育期栀子根际土壤真菌群落结构和多样性变化进行了分析，结果表明，栀子根际土壤真菌的OUT数量、群落丰富度指数ACE和Chao1、群落多样性指数Shannon和Simpson都表现为花蕾期>盛花期>果实膨大期>盛果期，且花蕾期样品中特有微生物种类最多，说明栀子花蕾期根际真菌的群落多样性最高，随着生育期的推进多样性逐渐降低，这一结果与以往报道相类似[16]。根系分泌物是根际微生物的主要物质和能量来源[17]，不同植物种类及同一植物在不同生长发育阶段，其根系分泌物的种类和数量均有一定的差异，此种差异又直接影响了根际微生物的群落组成[18]。在花蕾期和盛花期，栀子生殖生长和营养生长旺盛，根系生长代谢活跃，促进了植株根系分泌物增多，进而刺激了根际微生物的繁殖。而当栀子进入盛果期，植株代谢活动减弱，根际微生物数量和多样性又逐渐降低，该结果与赵柏霞等[19]研究结果一致。

不同生育期栀子根际真菌群落组成结果显示，4组土壤样品中的优势菌群主要包括子囊菌门、担子菌门和被孢霉门，各菌群在每组样品中所占的比例稍有差异，其中，被孢霉门在前3个时期样品中占优势，在盛果期样品中则明显占劣势；而担子菌门则在盛果期样品中占绝对优势。属水平的根际真菌群落组成分析显示，4个时期栀子根际优势真菌属(相对丰度>10 %)主要有被孢霉属、木霉属及乳菇属等，各样品的优势菌属存在一定差异，在盛果期样品中被孢霉属、轮枝菌属(Verticillium)和青霉属(Penicillium)相对丰度较其余3个时期小(相对丰度不足1 %)，而木霉属和乳菇属(Lactarius)的相对丰度则比其余3个时期大(相对丰度超过30 %)。这些结果说明栀子对其根际定殖的土壤真菌具有选择性，且生育期会影响根际真菌群落的结构和组成。多样性分析结果显示，花蕾期、盛花期及果实膨大期的根际土真菌群落结构相似，与盛果期的根际真菌群落结构差异明显，这也印证了根际微生物群落受植物生育期的影响，这些真菌之所以能在根际大量定殖可能与其生态功能有关[20]。此外，本研究通过对四组样品的LEfSe分析，发现栀子每个生育期根际土壤样品中都会有一些特有菌群或优势菌群，如银耳纲、粪壳菌目等真菌群落在M1样品中丰度较高；丛赤壳科和镰刀菌属在M2样品中丰度较高；柔膜菌目、锤舌菌纲和Plectosphaerellaceae科等在M3样品中存在丰富；而哈茨木霉、红菇科、肉座菌目等在M4样品中相对丰度较高。同时对根际优势真菌功能进行统计，发现这些优势真菌主要集中在子囊菌门、半知菌门和担子菌门所属的多个纲、目、科中。其中，益生真菌的主要功能是促进土壤养分的转化、增强作物对病原微生物的抵抗力，或与植物共生，产生一些促进作物生长的调节剂。因此，后续可通过解析这些益生微生物的促生机制，进而合理开发和利用这些益生微生物，为栀子的科学、高效栽培提供理论参考。