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健康/根腐病黄连根际土壤真菌组成与根部可培养真菌组成分析

2020-02-25伍晓丽李隆云陈大霞

西南农业学报 2020年11期
关键词:根腐病病株根际

伍晓丽,李隆云,王 钰,刘 飞,陈大霞

(1. 重庆市中药研究院种植研究所,重庆 400065;2. 中国中医科学院中药资源中心重庆分中心,重庆 400065;3. 重庆市中药研究院大健康中心,重庆 400065)

【研究意义】黄连(味连)(CoptischinensisFranch)为毛茛科植物黄连的干燥根茎,是我国内销和出口的大宗药用植物[1]。黄连味苦,性寒,归心、脾、胃、肝、胆、大肠经,用于湿热痞满、呕吐吞酸、高热神昏、牙痛、消渴、痈肿疔疮,外治湿疹、耳道流脓等症[2]。重庆石柱县是我国黄连重要道地产区,产量占我国黄连产量的60 %,世界产量的40 %。而根腐病是制约石柱黄连产业的主要病害,常年发病率10 %~20 %,严重的地块发病率60 %~90 %,甚至绝收,经济损失约4~5万元/667m2,给连农造成重大的经济损失[3]。该病目前尚无有效的防治方法。【前人研究进展】微生物是土壤生态系统最重要的组成部分,在土壤有机质转化、养分循环、肥力形成、污染物降解以及能量流动方面具有重要的作用[4-6]。Arancon、余妙等研究表明土壤微生物的数量和活性与植物发病率之间有很密切的关系[7-8]。由此推测,黄连土壤中的微生物组成可能对黄连根腐病的发生有较大影响。【本研究切入点】前期研究表明,黄连根腐病是真菌性病害[9],因此本研究用高通量测序方法测定了石柱4个黄连主产地根腐病植株和健康植株的根际土壤真菌,并对相对应的根部的真菌进行了分离鉴定,在此基础上比较根腐病/健康植株的根际土壤和根部的真菌组成。【拟解决的关键问题】为揭示土壤真菌与黄连根腐病发生的关系,以及明确黄连根腐病的病原菌奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

采样时期:在根腐病发病盛期(7-8月)后的9月;采样地点:石柱4个黄连主产地沙子镇(S)、冷水镇(L)、黄水镇(H)、枫木镇(F);黄连生长年限:二年生、三年生;黄连健康状况:健康植株(T1)、根腐病植株(T2)。

分别采集黄连植株和对应的根际土壤。按照五点法在每个地块选取采样点,一个地块的5个样品混匀为一个样。根际土壤取样采用“抖根法”,将土壤表面 5 cm 以上的土壤扒掉,将植株根系从土壤中挖出并抖掉与根系松散结合的土体,然后采集与根系紧密结合的土壤(0~4 mm)并用冰盒带回存于-80 ℃备用。相应植株置于无菌袋装回,用于分离根部真菌。共计16个土壤样品和16个根样品。采样点详细地理信息见表1。

表1 采样点地理信息

1.2 方法

1.2.1 土壤真菌总DNA提取及ITS序列扩增 参考宋旭红等[10]土壤真菌高通量测序分析。

1.2.2 黄连植株根部可培养真菌分析 ① 可培养真菌分离与纯化:黄连根部可培养真菌分离与纯化操作参考伍晓丽等[11]。②可培养真菌分子鉴定:采用B518259 Ezup 柱式真菌基因组 DNA 抽提试剂盒按照说明书操作提取分离出的真菌基因组DNA,经NanoDrop 2000 超微量分光光度计检测DNA含量后对ITS序列进行PCR扩增,扩增体系和操作参考伍晓丽等[11]。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测后送华大基因公司测序。引物序列如下。ITS1:TCCGTAGGTGAACCTGCGG;ITS4:TCCTCCGCTTATTGATATGC。③种群多样性和相似性分析:定义同种或同属菌株作为同一分类单元,计算根部分离的可培养真菌Shannon-Wiener 指数(H’)。计算公式如下,k为宿主体内内生真菌种类的总数;Pi是指某种内生真菌的菌株数占全部内生真菌菌株总数的百分率[12-13]。

2 结果与分析

2.1 黄连根际土壤真菌分析

2.1.1 病株/健株根际土壤真菌多样性比较 对采集地16个土壤真菌群落进行多样性统计,见表2。

表2 根际土壤样本真菌多样性指数

对T1和T2的Observed_species、Shannon指数等作配对t测验,结果病株和健株根际土壤真菌多样性没有显著性差别(P>0.05),见表3。

表3 病株/健株根际土壤真菌多样性指数配对t测验结果

2.1.2 病株/健株根际土壤真菌组成 根腐病病株和健株根际土壤有3351个共有OTUs,二者的特有OTUs数量不同。4个地点的病株和健株共有OTUs和特有OTUs也差异较大(图1)。

图1 黄连根际土壤真菌组成 OTUs Venn图Fig.1 The Venn figure of C. chinensis rhizosphere soil fungi OTUs

2.1.3 病株/健株根际土壤真菌在门、属、种水平的差异 病株和健株根际土壤真菌优势门是子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)和被孢霉门(Mortierellomycota)。健株根际土壤中不少门的真菌比病株根际土壤真菌高,前者球囊菌门(Glomeromycota)真菌是后者的2.56倍,壶菌门(Chytridiomycota)是2.35倍,虫菌门(Entomophthoromycota)是3.48倍, Aphelidiomycota门是19倍(图2)。

图2 健康和根腐病黄连根际土壤中门水平相对丰度排名前10的真菌分布Fig.2 The top 10 fungi in healthy and root rot C. chinensis rhizosphere soil at phylum level

无论是健株还是病株,根际土壤中丰度最高的属都是Saitozymasp.、Solicoccozymasp.、Archaeorhizomycessp.、Mortierellasp.、Fusariumsp.Aaosphaeriasp.、Trichocladiumsp.、Phomasp.、Trichodermasp.等。其中病株根际土壤中Phomasp.是健株根际土壤中的3.17倍,病株根际土壤中Aaosphaeriasp.是健株根际土壤中的5.69倍,健株根际土壤中Petriellasp.是病株根际土壤中的3.51倍,其余属差别不大(图3)。

图3 健康和根腐病黄连根际土壤中属水平相对丰度排名前10的真菌分布Fig.3 The top 10 fungi in healthy and root rot C. chinensis rhizosphere soil at genus level

2种黄连土壤中丰度高的真菌菌种均是S.podzolica、S.terricola、F.oxysporum、M.humilis、T.asperum、M.globulifera等。A.arxii在病株土壤中丰度是健株土壤的5.69倍,P.adonidicola在病株土壤中丰度是健株土壤的3.21倍, 健株根际土壤中C.geophilum是病株根际土壤中的18.36倍(图4)。

图4 健康和根腐病黄连根际土壤中种水平相对丰度排名前10的真菌分布Fig.4 The top 10 fungi in healthy and root rot C. chinensis rhizosphere soil at species level

对健株和病株根际土壤中在门水平、属水平、种水平排名前10的真菌的OTUs数和丰度进行配对t测验,结果差异均不显著(P>0.05,表4)。

表4 病株/健株根际土壤真菌门、属、种水平OTUs数和丰度配对t测验

2.2 黄连病株/健株根部可培养真菌的比较

2.2.1 病株/健株根部可培养真菌数量 从4个产地二、三年生的病株和健株共计16个样品的根部一共分离出真菌207株。各地的病株根分离出的真菌株数均比健株根多。尤其是沙子,病株根中分离到的菌株数是健株根的2.5倍(图5)。

图5 4个产地黄连病株/健株根部可培养真菌数量Fig.5 The cultivable fungi in healthy and rot C. chinensis root from 4 sampling points

2.2.2 病株/健株根部可培养真菌分离频率统计 健株根中共分离出真菌75株,属于38个种,26个属。病株根中共分离出真菌132株,属于54个种,29个属。健株根中优势种是C.orchidicola;病株根中优势种是P.herbarum。健株根中优势属是Cadophorasp.;病株根中优势属依次是Phomasp.、Ilyonectriasp.(表5)。

表5 黄连病株/健株根部可培养真菌种、属水平分离频率统计

续表5(Continued table 5)

2.2.3 不同产地病株/健株根部可培养真菌分别统计 从冷水镇天鹅村二、三年生根腐病黄连根部分离得到真菌共计26 株,属于16个种,13属;从该地健康黄连根部分离得到真菌共计 16 株,属于13个种,12属。

从枫木镇昌坪村二、三年生根腐病黄连根部分离得到真菌共计32株,属于 19个种,14属;从该地健康黄连根部分离得到真菌共计18株,属于14个种,11 属。

从黄水镇横店村二、三年生根腐病黄连根部分离得到真菌共计 34 株,属于16 个种,9属;从该地健康黄连根部分离得到真菌共计 25 株,属于13 个种,11属。

从沙子镇盘龙村二、三年生根腐病黄连根部分离得到真菌共计40株,属于 21个种,14属;从该地健康黄连根部分离得到真菌共计16株,属于 6个种,4属(表6~7)。

2.2.4 不同产地黄连根部可培养真菌Shannon-Wiener 指数 健株根部真菌在种水平Shannon-Wiener指数上枫木镇最高,沙子镇最低;在属水平上冷水镇最高,沙子镇最低。病株根部真菌在种水平上枫木镇最高,黄水镇最低;在属水平冷水镇最高,沙子镇最低。总体而言,从种水平上看,4个地方病株根部真菌多样性均比健株高,属水平上健株比病株高(表8)。

表8 不同产地黄连根部可培养真菌Shannon-Wiener 指数

3 讨 论

总体上看,病株和健株根际土壤真菌多样性没有显著性差异,且2种土壤中含量高的真菌在门水平、属水平、种水平的OTUs数和丰度差异均不显著。

土壤中的真菌可采用高通量测序法进行检测,而由于结果准确性不高,很少采用高通量测序技术检测植物体内的真菌,因此本研究采用组织分离法对黄连根部真菌进行研究。

健株根中优势种是C.orchidicola;优势属是Cadophorasp.;病株根中优势种是P.herbarum;优势属是Phomasp.、Ilyonectriasp。前期初步的离体回接研究结果显示,Ilyonectriasp.含有疑似病原真菌。总体而言,种水平上4个地方病株根部真菌多样性均比健株高,属水平上健株比病株高。

C.orchidicola在病株中的分离频率很低,仅1.52 %。却是健株根中的优势种,分离频率高达20 %。Cadophorasp.是健株中的优势属,分离频率21.33 %,在病株中分离频率仅1.52 %。且在4个产地变化趋势均一致,是一个规律性明显的现象。C.orchidicola(异名Leptodontidiumorchidicola)[14],属于深色有隔内生真菌(Dark septate endophytes,DSE)的一种。DSE是植物内生真菌的主要类群,它可与健康植物形成共生体而不引起植物病变,具有与菌根类似功能[15-16],且抗逆境、防病虫等功能显著,是目前研究的热点菌群[17-20]。因此,DSE被广泛应用于番茄、香蕉、黄瓜等植物的抗病研究[21-23]。

4 结 论

大体而言土壤中真菌数量及组成对根腐病的发生没有明显的影响。当然也不排除健康/根腐病黄连土壤中某些含量低的真菌有明显差别,尤其是致病菌。拟在通过分离、回接、鉴定确定根腐病病原菌后,重点对土壤中这部分菌进行比较。

病原菌可能是某一个属或几个属内的多种真菌。根部真菌属水平多样性的降低可能与根腐病发病相关。

DSE菌C.orchidicola在健康黄连根部含量远高于根腐病黄连根部,这是否是个规律性现象,黄连根条中还含有哪些DSE菌,它们与黄连根腐病的关系如何,值得进行进一步深入研究。

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