高脂膳食致便溏的小鼠肠道微生物群落和代谢组学的影响

摘 要：目的：考察薏苡仁对高脂膳食致便溏的小鼠肠道微生物群落和代谢组学的影响。方法：应用甘蓝与猪油自由进食的方式，制备脾虚小鼠模型。并以薏苡仁进行干预，考察治疗前后小鼠的体态及肠道菌群、肠道代谢组变化情况。结果：薏苡仁可以有效改善小鼠的脾虚症状。Phascolarctobacterium，Anaerovibrio为丰度差异性较大的菌属，共获得10个已报道或鉴定差异的代谢物，其缓解的便溏的主要通路为Primary bile acid biosynthesis。结论;薏苡仁可通过对肠道微生物及代谢物调节的方式改善便溏的症候。

关键词：薏苡仁;脾虚便溏;微生物组学;代谢组学

根据肠道代谢特点可知，发生脾虚便溏会导致排出粪便粘性增加，与正常粪便相比，溏便类似溏泥，其黏性大，湿度高。同水样便相比，流动性差;同便秘便相比，其质地滑腻，是结肠消化系统异常的一种表现。考虑到粪便的形态主要受到胃/小肠的消化情况及大肠部位菌群生长发酵的影响，粪便的形态可以直接反映人体的消化系统及肠道菌群的异常。

从营养代谢的角度出发，便溏同饮食关系密切。不考虑消化系统疾病/细菌感染的影响，油脂（如饱和脂肪酸、动物脂肪等）摄入过多，消化系统无法充分吸收，是产生便溏的主因之一。另一方面，与正常粪便相比，溏便水分及油脂含量高，在结肠段囤积的过程中，亦有可能反向影响肠道菌群的构成。

1 材料与方法

1.1 小鼠模型制备

模型小鼠共计28只，随机分为4组：模型组（高脂膳食建模）、空白组（不进行高脂膳食建模常规饲养）、及对照组（高脂膳食建模后饲食常规鼠粮），自由进食。单日喂食甘蓝10-15g/只，双日灌胃猪油3ml/只，自由进食、饮水。观察小鼠饮食周期，一般连续7d后，小鼠出现便溏。待小鼠粪便持续呈高湿高黏的塘泥状3d，确认模型建立成功。实验持续28d，取待测小鼠，禁食12h，喂食1g对应食物，3h后处死小鼠，取全部结肠，收集肠道内容物，作进一步研究。

1.2 肠道菌群特征

应用E.Z.N.A.Stool DNA Kit试剂对样本总DNA进行提取，对rRNA基因可变区（V3+V4）或特定基因片段进行PCR扩增。将合格的各上机测序文库（Index序列不可重复）梯度稀释后，并经过NaOH aq变性为单链，再使用MiSeq测序仪进行2×300bp的双端测序。

1.3 肠道代谢组特征

利用高效液相色谱串联高分辨率质谱仪TripleTOF 5600在正、负离子模式下，分别对小鼠的肠道代谢组检测。数据处理应用Simca-P+14.1软件进行多变量数据分析。在MBROLE，MetaboAnalyst数据库内，对Model-Coix组内的差异代谢物进行KEGG功能富集分析，以确定薏苡仁对于模型小鼠代谢调控的机制。

2 结果

显示经过不同饲养后，小鼠粪便内的微生物群落变化情况。由结果可知，门水平下各组的微生物群落结构并无显著性差异（P>0.05）。上述三组的优势菌种分别为Bacteroidetes、Firmicutes和Proteobacteria。该结果提示，本研究各组间在门水平下的差异性不大。本研究进一步分析了各组在属水平下的差异中列出了丰度最高的20个菌属的构成。经过对差异性的分析后可筛选出三组在属水平下，有差异性（p<0.05）的菌属包含：Streptophyta，Enterobacter，Mobilitalea，Clostridium，Phascolarctobacterium，Candidatus_Stoquefichus，Faecalimonas，Faecalibaculum，Anaerovibrio，Deltaproteobacteria_unclassified，Acutalibacter11个，其中，以Phascolarctobacterium，Anaerovibrio为丰度较大的菌属。该结果提示，上述两个菌属为薏苡仁缓解便溏过程中，影响较大的菌属。

经过对各组内差异代谢物的定量分析后可知，Control-Model组内，共有649个上调和346个下调的差异阳离子代谢物，781个上调和320个下调的差异阴离子代谢物。Model-Coix组内，共有139个上调和60个下调的差异阳离子代谢物，213个上调的和99个下调的差异阴离子代谢物。最终共获得了5个上调和1个下调的差异阳离子代谢物，26个上调的和0个下调的差异阴离子代谢物。对上述32个化合物进行KEGG功能富集后，共获得10个已报道/鉴定的化合物，Spergualin Promazine，N1，N12-Diacetylspermine，Isolithocholate，Gymnodimine，Diisononyl_phthalate，Cassaidine，6-Ethylchenodeoxycholic_acid，3-Oxo-5beta-cholanate，3alpha，7alpha，12alpha，26-Tetrahydroxy-5beta-cholestane和Paspaline。薏苡仁對于模型小鼠的代谢通路共有38条，然而，除了Primary bile acid biosynthesis通路的p值<0.05外，其他代谢通路的p值>0.05。该结果提示，薏苡仁缓解的便溏的主要通路为Primary bile acid biosynthesis。

3 讨论

通过深入考察便溏小鼠肠道内的肠道菌群-宿主代谢组学特点，本研究筛选此过程中的关键代谢产物;再对比解析便溏小鼠肠道酸环境及菌群构成的影响，从而递进式的揭示其调控机制。本研究从代谢角度解释脾虚便溏症候对肠道代谢乃至微生物群落的影响，亦可为后续的脾虚症候、药物以及复方研究提供研究基础，并为未来进一步的症候发生的机制研究提供相应的指导。

课题项目：本项目受辽宁经济职业技术学院科研处项目支持（编号Ljz2018-qn-07）

作者简介：蒋亦昕（1988-），女，广西桂林人，汉族，硕士，讲师，研究方向：生物信息学。