菌丝内生细菌及其宿主真菌共生体系研究进展

吴远征，李金萍，李丹丹，刘宝军，扈进冬，李纪顺，杨合同*

(齐鲁工业大学(山东省科学院) a. 山东省科学院生态研究所; b. 国际合作处，山东 济南 250014)

共生一词起源于希腊语“symbioun”，意为“共同生活”，由Anton de Bary于1879年定义为“两个不同生物共同生活，存在紧密联系，通常至少有益于一方”[1-2]。共生对塑造真核生物的进化和多样性产生重要影响[3]。大多数真核生物与微生物(例如细菌和真菌)的复杂群落密切相关，而微生物对真核生物的发育、健康和生态起着关键作用[4-5]。

作为自然界中广泛分布的真菌-细菌联合体，对二者共生关系的认识，能够对农业生产、环境和医学等方面的实际应用产生积极影响[6]。最新研究表明，许多与植物相关的真菌，包括叶状子囊菌、深色隔生内生菌(dark septate endophytes, DSE)、丛枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi, AMF)、外生菌根担子菌和蜡壳耳目内生菌以及土壤生态系统中的一些植物病原性真菌和中性真菌，都携带着系统发育关系高度多样性的附生和内生细菌[7-12]。这些细菌大多附属于α-、β-、γ-变形杆菌，柔膜菌，芽孢杆菌，噬几丁质菌等，能够改变宿主形态、孢子形成、代谢产物的产生，甚至改变与植物相互作用所涉及的其他特性[13-15]。但是，目前对真菌-共生功能体内相互作用机制的全面评估有待深入研究[16-17]。

在植物根部和叶部内生真菌的菌丝内部经常生活着高度多样化的细菌，这类细菌被称为菌丝内生细菌(endohyphal bacteria, EHB)[18]。EHB现象最早发现于菌根真菌的菌丝内部[19-20]，其宿主内生真菌呈现高度多样性，分离自不同的植物类群，来源植物的地理分布也具有多样性[21]。目前对真菌-EHB这种引人注目的共生关系还没有充分研究，菌丝内共生体及其存在的生物学意义，特别是其对宿主真菌次级代谢的影响，尚待深入挖掘了解。本文综述了EHB及其与宿主真菌的共生体系，以及此类共生体系的复杂性及成员之间微妙的相互关系，为真菌生物学的新发现和新见解提供借鉴。

1 真菌-细菌联合体

1.1 类细菌

1970年，Mosse在研究蜂蜜色内囊霉属Endogone孢子发育过程中的细微结构变化时，发现了3类不同寻常的细胞器，即色素颗粒、大晶体和能自我复制的类细菌(bacterium-like organelles, BLOs)[19]。BLOs以自由形式存在于芽管和营养菌丝中，没有任何外膜包被，并且以独立分裂的方式增殖，对宿主真菌的形态没有明显的改变；当孢子从休眠转向静止状态时，这些平时处于潜伏状态的生物体会变得更加活跃，在宿主中多处部位形成菌落，膨胀成为尺寸更大的实体性结构，外观上更像细菌[19]。Wilson和Hanton将BLOs描述为大小(0.5～1.0)μm×(1.0～3.9)μm的革兰氏阴性的多形态杆状细菌，包裹在宿主真菌的液泡或细胞膜中；BLOs出现退化时则变为球形且没有细胞膜包裹[22]。通过对苏格兰球孢囊霉Glomuscaledonius、摩西球囊霉Glomusmosseae、光滑无梗囊霉Acauloporalaevis、珍珠巨孢囊霉Gigasporamargarita、异配巨孢囊霉Gigasporaheterogama和未鉴定的白色网状丛枝菌根孢子中BLOs的比较研究，发现BLOs是短暂型的原核细胞共生体，可被宿主真菌反复获取或丢失[20,23]。在发现BLOs的最初十余年，丛枝菌根真菌的系统发育分类仅通过形态学进行，且BLOs无法在无细胞培养基中培养，因此对BLOs的了解和描述并不充分[24]。

1.2 菌根辅助细菌

上世纪90年代，菌根辅助细菌(mycorrhiza helper bacteria, MHB)的概念被学者提出，用于描述那些能够刺激菌根共生形成的细菌类别[25]。MHB的发现始于Duponnois和Garbaye的间接土壤熏蒸实验，熏蒸处理对菌根真菌感染植物的抑制程度与定殖于土壤中的微生物类群差异有关，土壤微生物群落与菌根感染之间存在显著的相互作用[26]。外生菌根对照表明，土壤中微生物的辅助性反应是由特殊的细菌MHB所引起的[27]。MHB能够提高真菌孢子的萌发率和/或存活率，刺激菌丝体在共生形成之前的生长，增强植物短根对真菌信号的接受能力，刺激植物根与真菌菌丝间的识别，使之朝着利于菌根形成的方向发生改变[28]。MHB适应与宿主真菌生活在一起，且在离真菌较近的范围内群体更为丰富，二者之间的相互作用更多是种协同效应，在菌根共生体的生态和分布中起着关键性作用[29]。后来的研究均从经表面消毒的外生菌根中分离到了细菌，其中80%的细菌对菌根共生关系的建立有积极作用，其余20%为中性即没有明显的影响[30-31]。迄今已鉴定的MHB菌株属于许多细菌类和属，例如革兰氏阴性菌(农杆菌、固氮菌、固氮螺菌、伯克霍尔德氏菌、缓生根瘤菌、肠杆菌、假单胞菌、克雷伯菌和根瘤菌)，革兰氏阳性菌(芽孢杆菌、短杆菌和类芽孢杆菌)和放线菌(红球菌、链霉菌和节杆菌)[29]。

1.3 菌丝内生细菌

进入21世纪，研究者在植物根部和叶部内生真菌的菌丝内部发现存活有大量内生细菌，系统发育高度多样化，被称为菌丝内生细菌[18]。目前已知的EHB多存在于毛霉菌门(Mucoromycota)和球囊菌亚门(Glomeromycotina)。在叶部内生真菌中发现的EHB，与在专性共生真菌(例如球囊菌)中的EHB具有明显的系统发育差异[21]。部分EHB的作用已得到阐明，更多EHB对宿主真菌次级代谢产物的影响则有待深入研究。EHB可能在调节宿主真菌次生代谢中发挥着重要作用，EHB的丢失则可能导致宿主真菌培养过程中关键代谢产物的产量衰减。Hoffman等[32]发现EHB能促进其宿主真菌产生能够刺激植物生长的酶类物质如吲哚-3-乙酸等。在某些丛枝菌根真菌中，EHB有助于宿主真菌获得磷酸盐，这与磷酸盐的运输有关[33]。

菌丝内生细菌还能影响植物内生真菌的生态功能和多样性。在生物胁迫条件下，EHB对宿主真菌和/或宿主植物具有辅助性保护作用[34]，有助于激活参与识别过程、转录调节和初级代谢蛋白合成的基因[35]，影响宿主真菌的植物激素产量[32]，辅助调节宿主真菌生殖机制的主要相关组分或过程[36]，甚至负责产生宿主真菌的特征性植物毒素如根霉素等[37]。

2 已发现的真菌-EHB共生体系

2.1 与毛霉菌门有关联的EHB

2.1.1 与微孢根霉有关的菌丝内生伯克霍尔德氏菌

作为典型的植物病原真菌菌丝内生细菌，菌丝内生伯克霍尔德氏菌Burkholderiaendofungorum与微孢根霉Rhizopusmicrosporus形成共生联合体，微孢根霉是水稻幼苗枯萎病的致病菌，可产生称为根霉素的植物毒素，导致水稻幼苗根系的异常膨胀[37]。根霉素是一种环肽化合物，之前曾被错误地鉴定为真菌毒素[38]。Partida-Martinez等[11,37]突破性地研究发现根霉素不是由微孢根霉合成的，而是由菌丝内生伯克霍尔德氏菌合成的，这个发现揭示了一种非常复杂的共生-致病关系，将真菌与植物之间的相互作用范围扩展到了第三个关键参与方EHB。Scherlach等[39]进一步研究发现，根霉素的前体物质2,3-环氧乙烷环的合成酶类来自宿主真菌微孢根霉。因此，可以说两者在根霉素的生物合成中都起着重要作用。在没有EHB存在时，微孢根霉不能进行营养繁殖，其孢囊和孢子的产生也只有在EHB重新引入后才能得到恢复[37]。

根霉素具有潜在的抗真菌活性，抑制真核细胞有丝分裂，对多种肿瘤细胞株系有抑制作用，可以作为一种潜在的抗肿瘤药物[40]。根霉素的作用靶标指向β-微管蛋白，对脊椎动物和真菌等多种真核细胞具有拮抗能力，因此宿主真菌微孢根霉本身肯定对根霉素具有抵抗能力[40]。后来发现其他真菌类群对这种毒素也具有抗药性，这些抗性真菌分别属于子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)和接合菌门(Zygomycota)[41-42]。通过对来自36种不同真菌的49个β-微管蛋白序列进行分析，发现抵抗根霉素真菌的β-微管蛋白序列中氨基酸残基100起着重要作用，是一个关键的位点，氨基酸Ile-100、Val-100、Ser-100和Ala-100均能赋予菌株对该毒素的抗性[43]。对根霉素抗性的进化是维持宿主真菌与其菌丝内生细菌之间形成稳定联合体的关键。

此外，还发现EHB的III型分泌系统是建立这种共生关系的重要因素[44]。细菌细胞表面的多糖一般分为两大类：一类是与细胞壁结合成囊状的多糖即胞外多糖(EPS)，另一类是附在脂类A上的多糖即脂多糖(LPS)[45]。胞外多糖分泌到周围环境并在细胞表面积累，而脂多糖则锚定在细胞膜上，有助于细胞膜的稳定[46]。从根霉伯克霍尔德氏菌B.rhizoxinica中提取的脂多糖整体结构表明，O-抗原是形成稳定联合体的重要成分[47]，而未在微孢根霉与EHB的共生关系中发现胞外多糖具有显著作用[48]。

2.1.2 与长枝被孢霉有关的半胱氨酸嗜真菌分枝杆菌

Sato等[49]筛选和鉴定了产生氧化亚氮N2O的土壤真菌长枝被孢霉Mortierellaelongata，发现一种生活在长枝被孢霉菌丝内的细菌B1-EBT。16S rRNA基因测序结果表明，B1-EBT与巨孢囊霉杆菌Glomeribactergigasporarum(暂定名，属于伯克霍尔德氏菌科)密切相关。与存在EHB的长枝被孢霉菌株相比，不存在EHB的菌株所产生的细菌内毒素数量可以忽略不计，而EHB的存在与N2O的产生没有显著相关性[50]。采用传统方法无法分离培养B1-EBT，通过全基因组测序发现该细菌缺少参与半胱氨酸生物合成的关键基因以及糖酵解途径的相关基因，进而在补充添加半胱氨酸的培养基中成功地分离出B1-EBT，16S rRNA基因测序结果表明其属于伯克霍尔德氏菌科的一个单独分支——半胱氨酸嗜真菌分枝杆菌Mycoaviduscysteinexigens[51]。在此基础上，对从日本分离到的半胱氨酸嗜真菌分枝杆菌B1-EBT和根霉伯克霍尔德氏菌HKI 454T以及美国分离的半胱氨酸嗜真菌分枝杆菌Mc-AG77进行了基因组比较分析[34,39,50]，发现菌株B1-EBT和Mc-AG77基因组中都缺乏能侵染真菌细胞的几丁质水解酶(几丁质酶、壳聚糖酶)基因，却富含多种推定的毒素-抗毒素系统以及一种杀虫毒素复合物和一个定殖时控制内生细菌生长的PIN结构域[52]。

2.1.3 与梨形管囊霉有关的点形念珠藻

梨形管囊霉Geosiphonpyriformis和点形念珠藻Nostocpunctiforme之间存在一种非常罕见的联合关系，是唯一已知的真菌与蓝藻之间的共生[53-54]。梨形管囊霉是梨形管囊霉属的唯一种类，特征是能够形成丛枝菌根，产生含有蓝藻的单细胞多核囊；点形念珠藻的细胞不为真菌细胞壁所包围，以自由状态生活在宿主真菌的细胞质中[55]。点形念珠藻可以固定CO2为有机物，作为糖源为梨形管囊霉提供能量；在某些特定条件下，点形念珠藻还可以固定氮气，为宿主真菌提供氮素营养；同时点形念珠藻也从宿主真菌受益，梨形管囊霉可以为其提供矿物质营养如磷酸盐以及CO2。这两个联合体成员之间的关系具有稳定性，原因是蓝藻为宿主真菌提供糖源，而宿主真菌则为蓝藻进行光合作用提供所需要的基本物质[56]。

2.1.4 与丛枝菌根珍珠巨孢霉有关的巨孢囊霉杆菌

Bianciotto等[57]利用电子显微镜和细菌计数试剂盒(分子探针)发现珍珠巨孢霉Gigasporamargarita分离株BEG 34的孢子中有杆状原核细胞的存在。利用通用引物从珍珠巨囊霉孢子DNA中扩增得到16S RNA，序列分析表明其中的内生细菌与伯克霍尔德氏菌关系密切，可能是β-变形杆菌的一员。为了探讨这种联合体现象是否为巨孢霉科的共同特性，他们进一步研究了11株分属珍珠巨孢霉G.margarita、玫瑰红巨孢囊霉G.rosea、巨大巨孢囊霉G.gigantean、易误巨孢囊霉G.decipiens、波斯盾巨囊霉Scutellosporapersica和板栗盾巨囊霉S.castanea的分离株，发现除玫瑰红巨孢囊霉外，其他分离株均观察到形态相近的菌丝内生细菌，但巨大巨孢囊霉中细菌的形态略有不同，个体尺寸小且近圆形[58]。存在于珍珠巨孢囊霉、波斯盾巨囊霉和板栗盾巨囊霉细胞中的内生细菌属于单一分类群，形态上相似，暂定名为巨孢囊霉杆菌Glomeribactergigasporarum[58]。丛枝菌根真菌AMF繁殖过程中，内生细菌细胞质的稳定性及其在真菌繁殖过程中的繁殖传递表明，随着真菌菌丝体中细菌的活跃增殖，真菌通过AMF孢子的产生而使内生细菌发生垂直性传播；还发现这些细菌是其宿主真菌的专一性细胞内伴侣。珍珠巨孢霉的EHB能提高真菌的产孢能力，通过提高ATP的产生来为宿主真菌增加能量，还能够引发对活性氧解毒机制的启动，在宿主真菌的代谢、繁殖和抗逆能力中发挥着重要作用[59]。

2.1.5 与柔膜细菌目有关的内生细菌Mre

Naumann等[60]分析了内生细菌在球囊菌亚门(Glomeromycotina)中的分布情况，对来自四大洲的28种丛枝菌根真菌AMF培养物进行了评估，将内生细菌鉴定为一个新的分类群，与柔膜细菌目(Mollicutes)聚类在一起，与包括支原体目(Mycoplasmatales)和虫原体目(Entomoplasmatales)的分类群是姊妹关系。选取3种野生苔类植物的内生细菌与柔膜细菌目的序列聚类在一起，确定了新型系统发育类型的存在。利用荧光原位杂交技术(FISH)在AMF菌丝细胞质中发现了柔膜细菌目相关内生细菌(Mollicutes related endobacteria, Mre)的存在[61]。

由于AMF含有两类内生细菌，即柔膜细菌目相关内生细菌Mre和前述的巨孢囊霉杆菌Glomeribactergigasporarum(暂定名, CaGg)，因此对二者在AMF宿主中的分布模式和共存情况进行了研究，发现单个AMF可以同时容纳两种类型的内生细菌Mre和CaGg，并且与CaCg相比，Mre数量更多、更加多变以及能够发生重组现象[62]。在29个内囊霉Endogonespp.中发现了13种Mre，聚类分析表明内囊霉Mre与球囊菌Mre不同，构成单独的系统发育分支[63]。AMF体内的Mre分子进化模式研究表明，Mre在单个AMF内虽然表现出了多样性，但不同大陆来源的AMF中Mre之间的差异并不明显。Mre据推测可能是球囊菌的寄生物，而它们之间形成的稳定联合体是垂直传播和水平传播共同作用的结果，但这种联合体中二者的关系是否在相互拮抗和互惠之间反复地发生转换仍有待确认[64]。

Naito等[65]从丛枝菌根球囊菌中分离到一种新型EHB，暂定名为Moeniiplasmaglomeromycotorum，根据16S rRNA基因序列分析，该菌与Candidatusmoeniiplasma有相似之处，但19个基因的系统发育与支原体科(Mycoplasmataceae)成员类似。

最新研究发现，394株被孢毛霉亚门(Mortierellomycotina)菌株中有12株Mre存在，代表了一种新的细菌系统发育类型，毛霉菌门的所有种类都可以与Mre形成联合体关系，同时Mre可以一种非致命型生活方式拮抗其宿主真菌[66]。

2.2 与担子菌(Basidomycota)有关联的EHB

2.2.1 与外生菌根真菌双色蜡蘑有关的类芽孢杆菌

早期发现的EHB多见于毛霉菌门和球囊菌亚门。第一个发现存在EHB的外生菌根真菌是双色蜡蘑Laccariabiolor，属于担子菌类。双色蜡蘑菌株S238N已在法国商业化，用于苗圃中接种道格拉斯冷杉幼苗，以获得高效的造林用苗木，但在制备该菌株的接种物过程中，发现经常有大量的细菌繁殖，鉴定为类芽孢杆菌Paenibacillussp.。用特异性16SrRNA寡核苷酸探针进行FISH检测，发现该细菌定位于真菌菌丝的内部，但这种细菌在外生菌根与植物共生关系中的作用尚不清楚[67]。

2.2.2 玉米黑粉菌与短小芽孢杆菌形成的新型胞内固氮联合体

Ruiz-Herrera等[68]发现一株致病真菌玉米黑粉菌Ustilagomaydis能在无氮培养基上生长，具有固定大气氮的能力。进一步的研究发现在这种真菌体内存在一种能够固氮的内共生细菌EHB，用细菌16S rRNA和nifH基因扩增证实在真菌细胞确实存在着一种细菌，鉴定为短小芽孢杆菌Bacilluspumilus，是一种以自由方式生活的固氮菌。通过检测固氮酶活性确定了其固氮能力，并以掺入细胞同位素15N验证了固氮过程。

2.2.3 印度梨形孢与放射根瘤菌共生体

通过定量PCR、变性梯度凝胶电泳DGGE和FISH发现印度梨形孢Piriformosporaindica菌株DSM 11827与放射根瘤菌Rhizobiumradiobacter菌株F4存在密切的共生关系，根瘤菌随宿主真菌无性繁殖以及真菌植物定殖过程中垂直传播[69]。蜡壳耳目真菌Sebacinales与多种细菌具有稳定的联合共生关系[14]，其中3个属即类芽孢杆菌属Paenibacillusspp.、不动杆菌属Acinetobacterspp.、红球菌属Rhodococcusspp.与Sebacinavermifera相关联，而放射根瘤菌仅与印度梨形孢相关联[70]。

从印度梨形孢中能够分离到放射根瘤菌，无菌条件下的纯培养实验也获得了成功，但尝试获得不含根瘤菌的印度梨形孢纯培养物却屡屡失败。为了打破宿主真菌-EHB之间的这种联合共生，采取了多种策略如使用高浓度抗生素等，都没有成功地将二者分开，据推测EHB的缺失可能会降低宿主真菌的适合度[71]。在不同生长条件下分析了寄主真菌中EHB载量的影响因素，观察到放射根瘤菌确实能提高印度梨形孢的适合度，可以帮助三方成功地建立共生关系。

2.3 与子囊菌(Ascomycota)有关联的EHB

Hoffman等[18]2010年首次报道了植物叶部内生真菌的菌丝中存在着在系统发育方面具有多样性的内生细菌。他们对子囊菌类植物内生真菌中的EHB发生情况进行了探讨，包括多种子囊菌类植物病原菌、腐生菌和人类病原菌。结果表明这种子囊菌-EHB之间的共生关系广泛而普遍地存在，使用活/死细胞染色方法(SYTO9绿色荧光核酸染色和红色荧光核酸染色、碘化丙烯的混合物)在子囊菌菌丝中观察到内生细菌，并通过FISH分析确认。

作为常绿柏科植物Cupressaceaesempervirens的内生真菌，拟盘多毛孢Pestalotiopsisneglecta菌丝内生细菌藤黄色杆菌Luteibactersp.被成功分离获得了纯培养物，并将藤黄色杆菌重新引入到寄主真菌中，探讨EHB对宿主真菌的影响。发现宿主真菌的生长速度不依赖于EHB的存在，但是含有EHB的宿主菌株中吲哚乙酸的产量高于不含的宿主菌株[72]。

Soltani等[73]也探讨了与常绿柏科植物内生真菌相关的多种内生细菌的发生、多样性和潜在的生物活性，发现大约31%的常绿柏科植物内生真菌中含有内生细菌，还发现单一的真菌培养物含有单一的细菌种类。此外，枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis既是植物内生细菌，也是真菌菌丝的内生细菌，目前尚不清楚这种单一基因型的细菌如何同时适应这两种不同生活方式。

3 真菌-EHB共生体系中的二者关系

3.1 EHB进入宿主真菌的机制

尽管关于EHB的报道越来越多，但对EHB与真菌的结合方式或者EHB进入真菌菌丝的过程及相关机制的了解显然还不够[38,74]。最近的许多报道描述了微生物进入宿主细胞的方式，细菌一般是通过分泌蛋白质来抑制宿主细胞的防御系统，从而进入宿主细胞内部。

革兰氏阴性菌依赖于高效的蛋白质分泌系统包括I型～VI型(T1SS～T6SS)，将蛋白质或蛋白底物直接从细菌细胞转移到靶标真核生物或原核生物的细胞质膜中[75]。其分泌胞外蛋白的过程十分复杂，蛋白质需要穿过两层磷脂膜，第一步是通过Sec或者Tat系统进入细胞周质，然后再通过另外一个运输系统穿过外膜。此外，许多蛋白质也可通过独立于Sec或Tat的系统分泌。尽管细胞壁结构存在差异，革兰氏阳性菌输送蛋白质也涉及到Sec和Tat两种蛋白分泌系统，也有极少数革兰氏阳性细菌使用另外一个独特的分泌系统(T7SS)[75]。

Moebius等[76]基于基因组学和蛋白质组学的研究结果，发现了一种新的细菌融合现象，涉及到壳聚糖水解酶的分泌，电子显微镜照片揭示了细菌对真菌的实际感染过程。虽然壳聚糖是接合菌(Zygomycete)细胞壁的主要成分[77]，但细菌侵入真菌细胞的过程中只有几丁质水解酶起了重要作用。为建立真菌-EHB之间的密切关系，内生细菌还会在适当的时间和地点与宿主真菌发生物理性接触[78]，随后确定了两种相关的分子机制：一种是II型蛋白质分泌系统(T2SS)，另一种是几丁质酶分泌系统。几丁质酶参与二者的相互作用以及EHB对宿主真菌细胞的侵入，胞外几丁质酶的分泌和相关蛋白的易位是通过T2SS系统来完成的，几丁质酶软化了真菌细胞壁，从而帮助EHB进入到宿主真菌细胞内，这可以作为共生联合体关系的模型来探索二者之间的作用机制。

3.2 真菌-EHB二者关系的建立与转变

为探寻真菌与EHB共生体系中二者相互关系的转变，Lastovetsky等[79]以微孢根霉与EHB菌株伯克霍尔德氏菌为通用模型，进行了潜在分子机制方面的研究。结果表明，当微孢根霉细胞中含有内生伯克霍尔德氏菌时，就具有了对根霉素的抗性，原因是其β-微管蛋白的序列发生了突变[43]，由此可以推断二者关系已经从拮抗转向了互惠[47]。二者这种关系的转变得益于一种新的机制，主要包括宿主在脂质代谢过程中发生的变化，当脂代谢和磷脂酸合成酶被激活时，宿主与EHB便处于一种互惠互利的关系当中；相反当磷脂酸合成酶活性被抑制时，它们之间转为相互拮抗的关系。

在植物与微生物的相互作用中，真菌与菌丝内生细菌共生体对寄主植物的生活方式可能也会产生重要影响，可能是植物内生群落中的第三个关键组成部分[80-81]。真菌和细菌联合体的形成可能是化学信号通讯作用后的结果，即联合体成员中一方的代谢物会引起另一方的反应[82-83]。随着现代化技术方法的出现，可以利用转录组学、蛋白质组学和代谢组学技术来更好地探索真菌和细菌联合体形成过程中各个事件发生的细节[84-86]。

4 EHB的研究意义

菌丝内生细菌EHB的研究发现揭开了微生物生态学的一个新篇章。EHB与其宿主内生真菌形成的共生体系，对于阐明微生物共生的形成机制与进化过程、揭示EHB对宿主真菌甚至是植物的生存发育和适应能力的影响至关重要[87-88]。真菌-EHB共生联合体在改善植物营养，促进植物生长，提高抗病性、抗盐性、抗旱性，分解有毒物质，修复退化与污染环境，提高环境与食品安全性等方面发挥协同作用[89]。

多项研究表明，EHB能够改变共生联合体中的酶体系及其他代谢物质，进而影响植物-真菌间的相互作用，例如根霉-伯克霍尔德氏菌为代表的模型系统，其毒素的产生方式与致病性的分子基础令人着迷，是研究微生物相互作用的进化以及相互关系的范例。具有生理活性的次级代谢产物的分离发现是EHB研究的热门领域，对真菌致病性检测甚至抗肿瘤药物开发都具有指导意义[90]。

目前微生物组学(Microbiome)、宏基因组学(Metagenomics)和多-组学(Multi-omics)联合技术与高通量测序、单细胞测序技术的发展应用，以及次级代谢物分离分析技术的提高，结合新的计算工具和模型极大促进了EHB的研究[91-92]。德国马克斯普朗克植物育种研究所与瑞士学者利用微生物组学，成功从模式植物拟南芥Arabidopsisthaliana根和叶片中培养出了超过一半的细菌，利用纯培养获得的432个细菌菌株，研究人员可以在实验室中重建拟南芥根和叶中的任何微生物组[93]。在此基础上，开展微生物组研究和多单位、多地域的协同研究将会进一步加快植物内生微生物资源的研究和利用。

5 展望

EHB的多样性和生态重要性对于我们了解生态学和生物进化至关重要，通过对EHB内生生活方式的研究，能够模拟重建远古细菌状态，探讨细菌生活方式的演化轨迹，解析真菌-EHB在不同生态环境中的相互作用，发现生物进化中动态种群的演替过程。

有关EHB与内生真菌(包括有益真菌与有害真菌)及其宿主植物之间的相互作用、生理生态效应及其作用机制以及应用基础等方面，有待更广泛、更深入地给予系统、全面的研究与开发。随着技术发展与研究的深入，其新功能将不断被发现，EHB已经引起植物、微生物学家等的足够重视，成为研究的热门课题。

由于EHB分离培养、消除接种等技术的限制，大量的植物内生微生物资源仍处于未知状态。目前普遍使用的分离培养方法难以有效分离EHB，加之菌丝内生环境和人工培养环境的区别，这样可能导致内生微生物不容易形成菌落。许多研究主要集中在医药和农业方向，研究程度上也存在着“初步研究多，深入追究少”的缺点。

利用传统的非培养技术包括微生物组学、宏基因组学和多-组学等研究EHB内生微生物组，发掘其中丰富的菌种资源、遗传资源和生理活性物质资源，这也将为环境微生物多样性研究和新药物寻找注入活力和提供新的来源。可优先研究EHB与生防内生真菌在一些重要生理生态功能上的互补效应与机制，如两者协同诱导植物防御反应、提高植物与土壤健康状况等。针对不同植物种类、土壤条件、农艺管理体制等，筛选适宜不同生态条件、不同种类植物的EHB与内生真菌二元和多元复合生物制剂，为其应用提供技术依据。

菌丝内生细菌的研究蕴藏着丰富的可能性和极大的空间。随着现代分子、成像、培养和生物信息技术的进步，真菌-EHB共生体系的诸多方面仍然有待我们去阐明：(1)共生体系如何建立、进化和维持的多种支撑机制；(2)微生物共生如何影响宿主的发育、健康和生存；(3)微生物共生体如何帮助其伴侣适应快速变化的环境。通过跨学科研究人员的多种系统方法研究，将逐步揭示出自然界中共生体系的非凡之处，进而对加快真菌-EHB在农业生产中的应用，具有重要的理论和实践价值。