2株木霉抑菌效果及其促植物生长机制

张晓梦　田永强　潘晓梅　李佳佳　石晓玲　张建强　吴康莉

摘要：【目的】探究綠色木霉（Trichoderma viride）和棘孢木霉（T. asperellum）对8种植物病原菌的抑制效果及其促植物生长机制，为木霉防治植物病害和促进植物生长等的田间应用提供理论参考。【方法】采用平板对峙法和固体稀释法，检测2株木霉及其活性代谢产物对8种植物病原菌（棉花枯萎病菌、茄子菌核病菌、番茄链格孢病菌、茄腐镰刀病菌、尖孢镰刀病菌、枸杞炭疽病菌、番茄灰霉病菌和番茄匍柄霉病菌）的抑制率;采用平板透明圈法、Salkowski比色法及钼锑抗比色法测定2株木霉的生防因子、生长素及溶磷效果;通过辣椒盆栽试验，测定2株木霉发酵液不同稀释倍数处理对辣椒叶片叶绿素含量及3种抗性酶[过氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）和苯丙氨酸解氨酶（PAL）]活性的影响。【结果】平板对峙试验结果显示，2株木霉对8种植物病原菌的抑菌率均在60.00%以上;绿色木霉发酵11 d时其无菌滤液对茄子菌核病菌的抑制率达96.78%，但对其他病原菌的抑制率不高;棘孢木霉发酵11 d时无菌滤液对茄子菌核病菌、枸杞炭疽病菌和番茄链格孢病菌的抑制效果较好，抑菌率分别为99.08%、85.33%和68.65%，发酵9 d时无菌滤液对番茄灰霉病菌的抑制率为72.08%;2株木霉均可产生蛋白酶、几丁质酶、纤维素酶和铁载体4种生防因子;绿色木霉发酵9 d时分泌吲哚乙酸（IAA）量为3.389 mg/L，在PKO无机磷液体培养基培养7 d后溶磷量为67.236 μg/mL;棘孢木霉发酵11 d时分泌IAA量达11.638 mg/L，在PKO无机磷液体培养基培养7 d后溶磷量达151.905 μg/mL;盆栽试验结果表明，喷施不同稀释倍数的棘孢木霉发酵液较绿色木霉发酵液更能提高辣椒叶片叶绿素含量及3种抗性酶活性。【结论】供试2株木霉对8种植物病原菌均具有抑制能力并存在多种生防因子和促植物生长能力，其中棘孢木霉较绿色木霉具有更好的抑菌和促进植物生长及提高植物叶片叶绿素含量和抗性酶活性的能力，具有较好的田间应用潜力。

关键词： 绿色木霉;棘孢木霉;代谢产物;生防因子;抗性酶

中图分类号： S182; Q939.92                   文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2020）11-2713-09

Antifungal effect and plant growth promoting mechanism

of two Trichoderma strains

ZHANG Xiao-meng， TIAN Yong-qiang*， PAN Xiao-mei， LI Jia-jia， SHI Xiao-ling，

ZHANG Jian-qiang， WU Kang-li

（College of Chemistry and Biology， Lanzhou Jiaotong University， Lanzhou  730070， China）

Abstract：【Objective】To explore the inhibitory effect of Trichoderma viride and T. asperellum on eight plant pathogens and the mechanism of promoting plant growth so as to provide theoretical reference for their field application in preventing and controlling plant diseases and promoting plant growth. 【Method】The inhibition rates of two Trichoderma strains and its active metabolites against eight plant pathogens（Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum，Sclerotinia sclerotiorum，Alternaria solani，F. solani，F. oxysporum，Colletotrichum gloeosporioides，Botrytis cinerea，Stemphylium lycopersici） were detected by plate confrontation method and solid dilution method. The biocontrol factors， auxin and dissolved phosphorus of two Trichoderma strains were determined by plate transparent ring method， Salkowski colorimetric method and molybdenum-antimony colorimetric method. The content of chlorophyll and activities of peroxidase（POD）， polyphenol oxidase（PPO） and phenylalaninammo-nialyase（PAL） in the leaves were measured by pot pepper experiment before and after treatment with different dilutions of the two Trichoderma fermentation broths. 【Result】The results of the plate confrontation test showed thatthe inhibitory rate of the two Trichoderma strains on eight plant pathogens was more than 60.00%. When the T. viride was fermented for 11 d， the inhibition rate of the sterile filtrate against the Sclerotinia sclerotiorum reached 96.78%， and the inhibition rate against other pathogens was not high. The sterile filtrate of T. asperellum fermented for 11 d had inhibition on the pathogen of S. sclerotiorum， C. gloeosporioides and A. solani， which were 99.08%， 85.33%， and 68.65%， respectively，and the inhibition rate of sterile filtrate on B. cinerea was 72.08% after fermentation for 9 d. Two Trichoderma strains could produce protease， chitinase， cellulase， siderophore.The content of indole-3-acetic acid（IAA） reached 3.389 mg/L when fermentation for 9 d by T. viride， while the content of IAA was 11.638 mg/L at 11 d by T. asperellum. After being cultured in PKO inorganic phosphorus liquid medium for 7 d， the dissolved phosphorus amount of the two Trichoderma strains was 67.236 and 151.905 μg/mL， respectively. The pot experiment showed that the treatment of T. asperellum fermentation broth could increase the chlorophyll content and three resistant enzyme activities of pepper leaves more than T. viride. 【Conclusion】Two Trichoderma strains have the ability to inhibit eight plant pathogens and there are multiple biocontrol factors and can promote plant growth. Among them， T. asperellum has the better ability of bacteriostasis， promoting plant growth and increasing chlorophyll content and resistance enzyme activity in plant leaves than T. viride. It proves that T. asperellum has good development potential in field application.

Key words： Trichoderma viride; Trichoderma asperellum; metabolites;biocontrol factors; resistant enzymes

Fundation item： The Central Government Guiding Local Science and Technology Development Project（218173）;Science and Technology Major Project of Gansu（18ZD2NA005）; Gansu Provincial-level Competitive Project Guiding for Scientific and Technological Innovation and Development （2018ZX-11）

0 引言

【研究意义】在传统的植物栽培中，长期单一的优势品种大面积种植、连作及化肥的大量、不合理施用等致使植物病害连年加重，加之化学农药施用引起的生态环境失衡，导致农田生态系统日趋薄弱（袁扬等，2018）。近年来，有关微生物及其代谢产物防治土传病害，促进植物生长的报道逐年增多。木霉菌属（Trichoderma）部分真菌广泛存在于土壤和植物根系，是迄今为止防治植物病害中研究较多的生防菌（韩长志，2016）。木霉菌生长迅速、产孢能力强，可通过营养竞争、重寄生、分泌拮抗性次级代谢产物及诱导植物产生抗性等多种方式防治植物病害，同时可产生生长激素、降低土壤pH、提高养分利用率，进而改善土壤微生态环境，促进植物生长（Hermosa et al.，2012）。因此，研究木霉生防因子及其促植物生长机制，对保护生态环境和保障农业生产可持续发展均具有重要意义。【前人研究进展】目前，国内外学者研究较多的木霉主要有哈茨木霉（T. harzianum）、拟康宁木霉（T. pseudokoningii）、长枝木霉（T. longibrachialum）、绿色木霉（T. viride）和里氏木霉（T. reesei）等，发现木霉对大多数作物，如水稻、玉米、小麦、马铃薯、瓜类、番茄和棉花等的病害，以及一些园林植物和药用植物病害均有防治作用，且能促进植株生长，尤其是木霉在生长过程中会产生铁载体、蛋白酶、纤维素酶和几丁质酶等生防因子（Zhao and Zhang，2015），其与植物互作可诱导植物产生过氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）和苯丙氨酸解氨酶（PAL）等重要防御酶以防治植物病害（覃柳燕等，2017）。倪方方等（2017）发现哈茨木霉发酵滤液中的蛋白酶、纤维素酶、几丁质酶活性及生长素含量较高，可有效促进白术生长，降低发病率。台莲梅等（2018）利用分光光度法测定长枝木霉对大豆叶片防御酶活性变化的影响，发现木霉能诱导大豆叶片PAL、POD、PPO、超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化物酶（CAT）活性增强，有效防治大豆疫病。木霉与植物互作过程中，除了诱导植物产生抗性外，还产生生长素、赤霉素、脱落酸等植物激素及解磷、解钾物质，提高植物养分利用率。张英（2013）研究发现木霉培养液pH的降低与有效磷含量的增加存在一定相关性，说明木霉在盐碱地改良方面具有应用潜力。近几年，国外对棘孢木霉（T. asperellum）的研究相对较多，国内研究主要集中在棘孢木霉的抑菌能力方面，且证实棘孢木霉通过营养竞争、重寄生作用、抗生作用等多重生防机制抑制病原菌生长（张眉等，2019）。【本研究切入点】木霉属的一些种作为生物防治真菌不仅对生态环境友好，还具有防治植物土传病害、提高植物酶活、促进植物生长等多种功能。目前，已有较多研究表明木霉对单一病原菌的抑制效果及对植物的促生作用，但比较不同木霉对多种植物病原菌的抑制效果及木霉代谢产物抑菌能力与产生吲哚乙酸（IAA）含量间关系的研究报道较少。【拟解决的关键问题】比较棘孢木霉和绿色木霉及其代谢产物的抑菌活性，检测2种木霉发酵液中生防因子和促生物质的分泌情况，进一步通过辣椒盆栽试验检测2种木霉可能引起辣椒产生系统抗性的因素，以期为木霉防治植物病害、促进植物生长的田间应用提供理论参考。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

1. 1. 1 生防菌 绿色木霉购自中国工业微生物菌种保藏中心，编号为M1;棘孢木霉由兰州交通大学微生物学实验室分离鉴定，编号为M2。

1. 1. 2 植物病原真菌 棉花枯萎病菌（Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum）、茄子菌核病菌（Sclero-tinia sclerotiorum）、番茄链格孢病菌（Alternaria solani）、茄腐镰刀病菌（F. solani）、尖孢镰刀病菌（F. oxysporum）、枸杞炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）和番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea）均由甘肃农业大学植物保护学院保存提供，番茄匍柄霉病菌（Stemphylium lycopersici）由兰州交通大学微生物学实验室在番茄病株上分離获得。

1. 1. 3 培养基 PDA培养基、PKO无机磷培养基、脱脂牛奶琼脂培养基、Avicel培养基、几丁质检测培养基和CAS检测培养基（Palaniyandi et al.，2011;杨妍等，2019）。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 生防木霉活化 将M1和M2菌株从保存的斜面试管中转接到含有PDA培养基的平皿上活化，于28 ℃恒温培养箱中倒置培养72 h后转接培养。

1. 2. 2 木霉菌株抑菌率测定 采用平板对峙法，将培养7 d的8种病原菌用直径9 mm打孔器打取菌饼分别接种至灭菌的PDA培养基中央，于28 ℃恒温培养箱中培养24 h后，用灭菌牙签分别挑取活化培养的M1和M2菌株菌丝十字交叉接种于距病原菌2 cm处的培养基上，以只接种植物病原菌菌饼为对照，28 ℃黑暗条件下对峙培养5～7 d后测定抑菌率（黄雪莲和于新，2011）。每处理3个重复。

2. 3 木霉挥发性物质对病原菌的抑制作用

2株木霉产生的挥发性物质对不同病原菌具有不同的抑菌效果。由表1可知，M1和M2菌株产生的挥发性物质对番茄匍柄霉病菌、番茄灰霉病菌、枸杞炭疽病菌和茄子菌核病菌的抑菌率均在90.00%以上，且M1菌株对上述4种病原菌的抑制率较M2菌株略高;M1和M2菌株对番茄链格孢病菌的抑菌率在72.00%以上，对尖孢镰刀病菌、棉花枯萎病菌和茄腐镰刀病菌的抑制率均在42.00%以上。表明木霉产生的挥发性物质对番茄匍柄霉病菌、番茄灰霉病菌、枸杞炭疽病菌和茄子菌核病菌有较强的抑制作用，对番茄链格孢病菌的抑制作用次之。

2. 4 木霉生防因子及其促生长能力测定结果

2. 4. 1 木霉生防因子 蛋白酶、纤维素酶、几丁质酶和铁载体等因子是判断菌株是否具有生防作用的主要因素。从表2可看出，在4种生防因子中，M1和M2菌株产生的纤维素酶活性水平最高，蛋白酶和铁载体活性水平较高，几丁质酶活性相对较低。

2. 4. 2 木霉IAA含量 根据标准液IAA制作标准曲线（图4-A）。由图4-B可知，木霉菌株发酵液中IAA含量随着发酵时间的延长而变化，其中M2菌株发酵液中的IAA含量比M1菌株高，M1菌株发酵9 d时IAA含量达最大值，为3.389 mg/L，显著高于其他发酵时间处理，随后IAA含量呈下降趋势;M2菌株发酵液中的IAA含量呈先上升后下降再缓慢上升的变化趋势，发酵11 d时IAA含量达最高值，为11.638 mg/L，显著高于其他发酵时间处理。

2. 4. 3 木霉溶磷能力

2. 4. 3. 1 木霉溶磷能力定性测定结果 土壤中的磷元素大多数不能被植物吸收利用，而造成营养元素损失。如图5所示，根据溶磷圈直径（D）与菌落直径（d）比值初步确定，以磷酸三钙为唯一磷源的培养基培养2株木霉均出现不同程度的透明圈，表现出一定的溶磷能力，M1和M2菌株溶解无机磷的D/d比值分别为1.162和1.194。

2. 4. 3. 2 木霉溶磷能力定量测定结果 以梯度磷溶液的吸光值（OD700 nm）为纵坐标、梯度磷溶液的浓度为横坐标绘制标准曲线（图6）。利用钼锑抗比色法测定摇瓶培养的供试木霉菌株的溶磷能力，结果表明，M1菌株的溶磷量为67.236 μg/mL，比CK高65.483 μg/mL，M2菌株的溶磷量为151.905 μg/mL，比CK高150.152 μg/mL;2株木霉的溶磷量均高于对照，且M2菌株的溶磷量高于M1菌株。另外，培养液的pH值由初始的7.37，M1菌株降至5.21，M2菌株降至4.74，说明木霉具有较高的溶磷性能，且能降低土壤的碱性，对改良土壤有巨大的发展潜力。

2. 5 木霉对盆栽辣椒抗性酶活的影响

从表3可看出，经木霉发酵液处理过的辣椒叶片叶绿素含量及3种抗性酶活性水平均有所提高，其中，木霉发酵原液稀释150倍时M1菌株与M2菌株处理组间的叶绿素含量和PAL活性差异显著，而其他稀释倍数下二者间的叶绿素含量及3种抗性酶活性差异不显著。与CK相比，木霉发酵原液稀释100倍时M1和M2菌株处理组的叶绿素含量分别提高18.53%和27.72%，而稀释50和150倍的处理组叶绿素增加量大致相同。木霉发酵原液稀释50倍时，M1和M2菌株处理组的POD活性分别较CK提高27.60%和29.36%，但随着稀释倍数的增加其活性降低;稀释100倍时，M1和M2菌株处理组的PPO活性分别较CK提高58.73%和62.70%，PAL活性分别提高47.77%和49.06%，稀释150倍时2种酶活性的影响效应最低。木霉发酵液对辣椒叶片叶绿素含量及PPO和PAL活性以稀释100倍最佳，对POD活性以稀释50倍最佳;在3种酶活性中，木霉发酵液对PPO活性的影响效应最高。以上结果表明，喷施木霉发酵液可显著提高辣椒叶片叶绿素含量及3种抗性酶活性，且M2菌株整体上较M1菌株对辣椒叶片的影响效应更高。

3 讨论

木霉作为真菌生物防治剂已得到國内外学者的广泛研究，不同于化学药剂对环境的负面影响，其以生态友好和可持续发展的方式防治植物病害（叶旻硕等，2019），有效促进植物生长（Mousumi et al.，2019）。近年来，有关木霉产生防御酶的研究逐渐开展。陈金莲等（2015）研究发现拟康宁木霉可产生较多含量的铁载体;李闯等（2017）对木霉的生物学测试结果显示多种木霉均具有产纤维素酶、几丁质酶以及铁载体和解磷解钾、产生生长素的能力;罗鑫和于存（2019）、郑明子等（2019）研究结果表明，拟康宁木霉、哈茨木霉和深绿木霉产生的几丁质酶能有效防治植物病害;本研究结果显示绿色木霉和棘孢木霉具有较高的产蛋白酶和纤维素酶活性，与林润泽（2016）研究发现棘孢木霉、里氏木霉、拟康宁木霉、深绿木霉和长枝木霉产生蛋白酶、纤维素酶的结论一致。Zhao和Zhang（2015）研究发现棘孢木霉将难溶性磷转化为有效磷，产生生长素促进黄瓜植株生长;刘畅等（2019）研究发现棘孢木霉的活性代谢物质能促进小麦发芽生长;而在本研究中棘孢木霉产生大量生长素，溶磷能力达151.905 μg/mL，且能降低土壤的pH，棘孢木霉的这些特性可能是促进植物生长的主要因素。刘淑宇等（2013）通过测定绿色木霉发酵液对芒果果实抗性酶活性的影响，证实木霉发酵液可抑制病原菌生长，并提高作物叶片PAL、PPO和POD等抗氧化酶活性;覃柳燕等（2017）研究发现棘孢木霉均可提高香蕉植株SOD、POD和CAT抗氧化酶活性;而本研究的盆栽辣椒试验结果显示在2株木霉中，除绿色木霉50和150倍液处理未显著提高辣椒叶片叶绿素含量外，其他处理相比CK均显著提高了辣椒叶片的叶绿素含量及抗性酶活性;除对POD活性以稀释倍数50倍为最佳外，对叶绿素含量、PPO和PAL活性均以稀释100倍为最佳，证明植物经木霉诱导后体内多种酶活增加与木霉分泌的多种物质共同防御植物病害，促进了植物生长，同时为木霉在工农业生产中应用提供了一定理论支持。

本研究发现木霉发酵液随着发酵时间的延长，M1菌株发酵液对棉花枯萎病菌、番茄链格孢病菌、尖孢镰刀病菌、枸杞炭疽病菌、番茄匍柄霉病菌的抑制率及M2菌株发酵液对茄子菌核病菌、番茄灰霉病菌、番茄匍柄霉病菌的抑制率呈逐漸上升再下降再缓慢上升的变化趋势，与发酵液随着发酵时间的延长，木霉菌株发酵液中IAA含量先逐渐上升再下降再平缓上升的趋势大致相同。木霉的挥发性代谢产物和发酵液对8种病原菌的抑制效果存在差异，本研究中绿色木霉和棘孢木霉的挥发性代谢物质除对茄子菌核病菌外，对其他7种病原菌的抑制率均高于发酵液的抑菌率，与Parizi等（2012）的研究结果基本一致。本研究发现棘孢木霉对病原菌的抑制作用和促进植物生长及提高植物叶绿素含量、抗性酶活性方面整体比绿色木霉更为明显，下一步将对棘孢木霉进行更深入的探究，以最大限度地挖掘棘孢木霉的抑菌能力及促生长作用。

4 结论

绿色木霉和棘孢木霉及其代谢产物对8种植物病原菌均具有抑制能力，且含有蛋白酶、纤维素酶、几丁质酶和铁载体等生防因子;与绿色木霉相比，棘孢木霉更具抑菌和促进植物生长及提高植物叶片叶绿素含量和抗性酶活能力，具有较好的田间应用潜力。

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（责任编辑 麻小燕）

收稿日期：2020-01-14

基金项目：中央引导地方科技专项（2181730）;甘肃省科技重大专项（18ZD2NA005）;甘肃省省级引导科技创新发展竞争性专项（2018ZX-11）

作者简介：*为通讯作者，田永强（1972-），教授，主要从事微生物工程研究工作，E-mail：tian2918@163.com。张晓梦（1995-），研究方向为拮抗微生物学，E-mail：1185588617@qq.com