不同连作年限怀牛膝根际芽孢杆菌和镰刀菌的多样性分析

陈婷　王娟英　吴林坤　陈军　吴红淼　林生　林文雄

摘要：【目的】针对药用植物怀牛膝耐连作甚至表现连作促进的特殊现象，分析不同连作年限怀牛膝根际土壤关键微生物群落结构变化，探讨不同连作年限怀牛膝根际微生物组的演变过程，为破解大多数药用植物连作障碍提供理论借鉴。【方法】本研究以连作1年、10年、15年怀牛膝根际土壤与撂荒田对照土壤为试验材料，采用变性梯度凝胶电泳（DGGE）技术分析芽孢杆菌属和镰刀菌属群落结构差异。【结果】在怀牛膝根际土壤中，芽孢杆菌属种类丰富，其中优势菌群为枯草芽孢杆菌（Bacillus stubtilis）和蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）;且与1年土壤相比，连作10年和15年的土壤中会明显增加枯草芽孢杆菌和耐盐芽孢杆菌的相对含量。镰刀菌属的条带数日相对较少，种类多样性少，在群落结构上CK和15Y比较相似，1年和10年相似，优势菌群为腐皮镰刀菌（Fusariumsolani）和尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）。qPCR定量分析显示，怀牛膝连作下会增加其有益细菌的含量，而有害菌镰刀菌属基本维持在一个水平。【结论】多年连作怀牛膝能够增加根际有益微生物群落的多样性与种群丰度，抑制病原微生物群落的多样性与种群丰度，通过选择性促抑影响根际微生物组成而自我塑造健康的根际微生态环境。

关键词：怀牛膝;连作;芽孢杆菌;镰刀菌;DGGE

中图分类号：S 567

文献标志码：A

文章编号：1008-0384（2020）11-1234-10

0引言

【研究意义】据统计，70%块根类药材都存在非常严重的连作障碍现象（如地黄、太子参、人参、三七等）[1-3]。然而，同样是常用大宗中药材，怀牛膝（Achvranthes bidentata Blume）与大多数忌连作的药用植物不同。它是一种耐连作的中药植物[4-6]。其以地下部块根入药，因主产于古怀庆府（今焦作市）状似牛的膝盖而得名，以河南省温县和焦作栽培历史最为悠久，品质优，产量高。在河南省生态观察站长期定点观察发现，在连作田块上种植怀牛膝产量比头茬种植的怀牛膝产量增产1.66倍[7]。而种植于临近地块的地黄却表现严重的连作障碍现象，出现随种植年限的延长其产量与质量显著降低趋势[1]。本课题组研究认为造成两种药用植物对连作响应如此不同的原因，主要与连作导致的根际微生物组成发生不同演变有关[8]。故此，分析不同连作年限怀牛膝根际土壤关键微生物群落结构变化，探讨不同连作年限怀牛膝根际微生物组的演变过程，不仅对于丰富作物根际生态学内容有重要意义，而且对于进一步探索利用良好根际微生物组形成条件与调控策略，破解绝大多数药用植物单一化栽培所带来的连作障碍难题也具有重要的理论意义和潜在的应用价值。【前人研究进展】随着对土壤环境的深入了解，越来越多的学者意识到根际土壤微生物区系的变化对作物健康起着关键作用[9]。研究发现，土壤微生物的活性、数量及其群落结构的变化，直接影响着植物对养分和水分的吸收，也影响着植物对恶劣环境的抵抗能力[10]。土壤微生物作为生态系统的重要组成部分，直接参与了土壤中许多的生理生化反应，土壤微生物的活性是否能够促进物质能量的良好循环是土壤生态系统发育成熟的重要标志[11-12]。研究表明，药用植物的连作障碍现象表现为连作后，其根际的土壤环境发生巨大改变，根际土壤微生物的真菌型群落占据了主导地位，抑制了细菌型群落的发展，导致细菌总量降低，多样性指数显著减少[10，l13-14]。吴林坤[15]通过对地黄研究发现，连作下的细菌（如假单胞菌和芽孢杆菌属）的含量都会随连作年限的增加而显著下降，但真菌群落（如尖孢镰刀菌和镰刀菌属）的变化却呈现相反的趋势。可见，这种微生物区系的变化，包括有益菌减少而病原菌增加，正是导致地黄连作障碍形成的重要因素。然而，课题组前期对不同连作怀牛膝根际土壤微生物分析发现有益菌（如假单胞菌和芽孢杆菌属）含量随连作年限的增加而增加，这是怀牛膝耐连作的生物学基础[4-7]。芽孢杆菌属是土壤中最主要的细菌属之一，在土壤生态系统中发挥多种生态功能。据报道，该属大部分物种都是有益菌，可通过获取养分、产生植物激素、保护植物免受病原体和其他非生物胁迫的作用从而直接或间接地促进植物生长。在许多不同的农田和园艺作物中（如黄瓜、水稻、玉米、油菜等）都报道了将芽孢杆菌用作植物促生菌（PGPR）来防治作物病虫害，且表现出良好的防治效果[16]。而镰刀菌属（Fusarium）是一类包含许多能产生类固醇大分生孢子的真菌，广泛分布在土壤和有机基质中。镰刀菌长期以来被认为是重要的植物病原菌，因为它具有很强的攻击宿主植物的能力，造成植物枯萎病和茎杆腐烂等[17-18]。【本研究切入点】芽孢杆菌属与镰刀菌属这两种重要的微生物在连作怀牛膝根际是如何演变的，尚不清楚。因此，为了在生物控制中更好地了解和应用微生物群落的多样性潜力，需要进一步研究来阐明这两种潜在重要微生物的变化。【拟解决的关键问题】本研究利用DGGE技术分析不同连作年限怀牛膝根际芽孢杆菌属以及镰刀菌属的群落变化，以期揭示不同连作年限下怀牛膝根际土壤中两种微生物群落结构和多样性的变化情况，为后续探索怀牛膝耐连作潜在机制奠定基础。

1材料与方法

1.1材料

本研究試验地位于河南省武陟县驾部村（34°59′49″N，113°15′56″E），该区域土壤为碱性砂壤土。试验以广泛种植怀牛膝品种核桃纹为供试品种，于6月份在不同连作年限的怀牛膝大田土壤中种植，采用土壤深耕整地后撒播，播种用种量为9～10kg·hm-2，将种子拌入适量细土均匀洒播。出苗后待苗高6cm左右后间苗，保持苗间距规格为20cm×15cm，整个试验过程的田间管理如水分管理、药肥施用等措施相同。试验共设置4个处理，即撂荒田（空白对照，CK）、连作1年（1Y）、连作10年（10Y）和连作15年（15Y）的怀牛膝大田土壤。每个处理设置3个试验小区，小区面积25m2。在10月份怀牛膝地下部膨大期，在每个试验小区中按照5点取样法采集怀牛膝根际土壤，并用0.2mm的筛子筛出土壤中的植物根等杂质，过筛的土壤置于-80℃保存备用。

1.2土壤总DNA的提取

使用BioFlux公司（杭州，中国）的BioFast soilGenomic DNA Extraction Kit提取试剂盒提取土壤总DNA。提取步骤按照说明书上操作。将提取的土壤总DNA经1.2%琼脂糖电泳检测后，于-20℃冰箱保存备用。

1.3芽孢杆菌属和镰刀菌属的巢氏PCR扩增

巢氏PCR采用提取的土壤总DNA样品为模版，50μL反应体系：2×PCR预混溶液25μL，上下游引物各1μL，DNA模版1μL，ddH2O22μL。扩增引物及程序见表1。芽孢杆菌属采用引物对R1378和Bacf先进行第一轮PCR扩增，然后将第一轮产物稀释20倍作为DNA模版，用引物对F968-GC和R1378进行第二轮PCR扩增。镰刀菌属采用引物对EF-1和EF-2进行第一轮PCR扩增，将第一轮PCR产物作为模版，用引物对Alfie-GC和Alfie-2进行第二轮PCR扩增。最终获得的PCR产物采用Gel ExtractionKit胶回收试剂盒进行纯化回收后备用。

1.4芽孢杆菌属和镰刀菌属的DGGE过程

清洗整个DGGE自动灌胶系统，制备变性梯度为45%～55%（芽孢杆菌属）或35%～45%（镰刀菌属）的变性胶，预热DGGE电泳槽中的1×TAE溶液至60℃后，将制好的凝胶放入到电泳槽预电泳15min后上样。在80V、60℃条件下电泳16h（芽孢杆菌属）或12.5h（镰刀菌属）。

电泳完成后对变性胶进行银染，方法如下：将胶放入固定液（含有0.5%冰醋酸，10%乙醇），50r·min-1振蕩15min;倒掉固定液，用双蒸水清洗两次，每次2min;再将变性胶放入染色液（含有0.2%AgNO3，0.1%甲醛），50r·min-1避光银染20min;倒掉染色液，用双蒸水清洗两次，每次1min;加入显影液（含有1.5%NaOH，0.1%甲醛），50r·min-1震荡至出现明显条带;倒掉显影液，用双蒸水清洗2遍后将变性胶置于凝胶成像仪上拍照。

1.5梯度变性胶的条带回收及鉴定

将目的条带切下并放入1.5mL离心管中，用150μL无菌水洗涤3次，加入40μL无菌水于4℃下浸泡过夜，10000g离心10min。取上清液作为模版，以两种菌第二轮PCR的引物进行PCR，体系和程序步骤均同上。将回收产物用TransGene Biotech公司的pEASY-T1Simple Cloning Vector和TransGene Biotech公司的Trans-T1 Phage Resistant感受态细胞进行克隆。克隆产物送至测序公司（福州伯尚）测序，所得序列在NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）网站上进行比对分析。

1.6土壤中芽孢杆菌属及尖孢镰刀菌的实时荧光定量

qPCR采用土壤总DNA作为模板，R1378/Bacf（芽孢杆菌属）和ITS1F/AFP308（尖孢镰刀菌）为引物（表1）。反应总体积为15μL，其中2×Taqmixture7.5μL，上下游引物各0.6μL，ddH2O5.3μL，DNA模版1.0μL。标准曲线制作：用已知种/属的阳性克隆子扩增培养后提取质粒DNA，用Nanodrop检测其浓度和纯度后，将质粒稀释成（1、0.5、0.1、0.05、0.01、0.005、0.001、0.0005）8个梯度作为标准样品，计算芽孢杆菌属及尖孢镰刀菌的基因拷贝数。

1.7数据分析

使用BIORAD公司的Quantity One软件对DGGE图谱进行数字化分析。使用SPSS Statistics 22.0对Quantity One软件处理得到的数据进行主成分分析。多样性分析以及显著性分析等使用DPS 7.05软件进行。

2结果与分析

2.1根际土壤微生物总DNA的提取及PCR扩增

由图1可知，土壤总DNA提取试剂盒（BioFastSoil Genomic DNA Extraction Kit，杭州，中国）适合怀牛膝根际土壤总DNA的提取，提取的DNA条带清晰（图1-A），无降解，可用于后续PCR扩增。采用巢式PCR能够稳定扩增出约410bp的芽孢杆菌属特异片段（图1-B）和约500 bp的镰刀菌属特异片段（图1-C）。

2.2怀牛膝根际土壤芽孢杆菌属多样性分析

2.2.1怀牛膝根际土壤茅孢杆菌属DGGE条带分析

图2为不同连作年限下的怀牛膝根际土壤芽孢杆菌群落结构的变化。每个泳道中不同的条带代表不同的芽孢杆菌基因片段，条带的亮度反映出菌群的相对含量。从图中结果可以看出：不同连作土壤间芽孢杆菌条带存在差异，但同一年的样品3个重复之间相似度很好。图谱的条带位置信息利用Quantity One软件转化成了数字化的信息，以便后续分析。

2.2.2芽孢杆菌属的主成分分析 利用Quantity one软件分析得到的灰度值，在SPSS软件上对4种不同年限的土壤芽孢杆菌DGGE结果进行主成分分析（图3）。主成分1和主成分2的累计贡献值达到86.17%，具有较好的代表性。如图3所示，CK位于主成分1轴负端，1Y位于主成分2轴正端，10Y位于主成分1轴和2轴交叉处，15Y位于主成分2轴负端，可见主成分1和主成分2能基本区分不同连作年限的怀牛膝根际土壤芽孢杆菌菌落特征。

2.2.3芽孢杆菌属的多样性分析 怀牛膝根际土壤芽孢杆菌群落的Simpson指数、Shannon指数、均匀度指数和Brillouin指数的分析结果表明（表2），随着连作年限的增加，土壤芽孢杆菌的Simpson指数和均匀度相对稳定，Shannon和Brillouin指数增加。

2.2.4芽孢杆菌属的条带序列分析 芽孢杆菌属的DGGE胶共挖取37个条带进行鉴定，全部条带鉴定成功。4种土壤样品都分离出了不同强度和数量的条带，说明每种样品具有较丰富的芽孢杆菌种群多样性。通过Blast网站序列比对进行定性分析（表3），选择同源性为100%的微生物种属，这些种类主要包括11类：枯草芽孢杆菌（Bacillus stubtilis）（条带3、4、20、21、26、27），蜡样芽孢杆菌（Bacilluscereus）（条带7、8、22、24、25），解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）（条带13、16、29），耐盐芽孢杆菌（Bacillus halodurans）（条带32、33），蕈状芽孢杆菌（Bacillus mvcoides）（条带2、5），奥德赛芽孢杆菌（Bacillus odvssevi）（条带23），短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）（条带18、19、28），芽孢杆菌（Bacillus sp.）（条带1、11、14、30、31、35、37），另外有4条经鉴定为其他类别菌（短状杆菌Brachvbacterium sp.（条带6）和嗜麦芽糖寡养单胞菌.Stenotrophomonas maltophilia（条带1 2、1 7、34））和4个不可培养的未知菌种（Uncultured bacterium条带9、10、15、36）。样品CK中最亮的条带是7、8和9，表明优势菌群为蜡样芽孢杆菌和不可培养菌。1Y样品中最亮的条带是3、5和7，表明优势菌群为枯草芽孢杆菌、蕈状芽胞杆菌和蜡样芽孢杆菌。样品IOY和15Y中最亮的条带是20、21、22和8，表明优势菌群为枯草芽孢杆菌、耐盐芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌。与1Y相比，10Y中多出的条带20、21、27都为枯草芽孢杆菌，而15Y中多出的条带为20、21、32、33，其中条带32、33为耐盐芽孢杆菌。

2.3怀牛膝根际土壤镰刀菌属多样性分析

2.3.1怀牛膝根际土壤镰刀菌属DGGE条带分析图4是怀牛膝根际土壤镰刀菌属的DGGE图谱。从中可知，4种不同连作年限怀牛膝土壤中，CK和15Y条带分布比较相似，1Y和10Y条带分布相似，条带的数目没有明显增加的趋势。

2.3.2镰刀菌属的主成分分析 对4种土壤镰刀菌属进行主成分分析（图5）。主成分1解释48.5%的变量方差和主成分2解释29.31%的变量方差，累积贡献为77.81%。观察图5可知，4个样品位于坐标轴的4个象限，在主成分1上CK和15Y比较相似，1Y和10Y相似，主要在主成分2上样品间有差异。

2.3.3镰刀菌属的多样性分析 镰刀菌属群落的Simpson指数、Shannon指数、均匀度指数以及Brillouin指数的分析结果显示（表4），各指数均出随着连作年限的增加略有增加的变化趋势。

2.3.4镰刀菌属的条带序列分析 将4种样品中的条带（F1～15）对应的PCR产物进行连接T-载体后双向测序并拼接，将所得结果在NCBI中进行相似性比对，选择同源性为100%的微生物种属，结果见表5。经鉴定结果可知，镰刀菌种类主要包括以下4类：尖孢镰刀菌（Fusarium oxvsporum）（條带2、6、8、12），腐皮镰刀菌（Fusarium solani）（条带1、3、4、9、10、11、13），木贼镰刀菌（Fusarium equiseti）（条带5）和镰刀菌（Fusarium sp）（条带7、14），其中尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）和腐皮镰刀菌（Fusarium solani）是怀牛膝根际土壤中镰刀菌属的优势菌群。由DGGE图谱可知，不同连作下怀牛膝根际样品中最亮的条带是11、12和13，表明优势菌群为腐皮镰刀菌（Fusarium solani）和尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）。

2.4芽孢杆菌和尖孢镰刀菌的qPCR绝对定量分析

试验进一步对关键微生物菌群芽孢杆菌和尖孢镰刀菌的含量进行qPCR绝对定量分析。基于qPCR定量的特异引物，建立标准曲线。定量结果如图6所示：在连作1～10年，芽孢杆菌的含量无显著差异，连作15年表现显著上升趋势。而尖孢镰刀菌的数量则稳定在一个水平。

3讨论

根际环境是指植物根系活动所依赖的土壤微域环境，它是一个复杂的、动态的微型生态系统，在植物生长、吸收、分泌过程中扮演着重要角色。而在这片区域活动的最为活跃的根际土壤微生物也被称为植物的第二基因组，近年来已成为学者们的研究焦点[8，24]。植物根际微生物包括固氮菌，根际促生菌和真菌在内的微生物群落组成和丰度的变化可以显著影响根际土壤的活性与物质能量的循环过程，从而影响植株生长。Wu等[1]发现，连作下地黄产量与品质明显下降，是因为随着连作年限的增加，根际中对致病性尖孢镰刀菌具有拮抗活性的有益菌（如假单胞菌，芽孢杆菌）种群显著减少。华菊玲等[25]发现，连作下芝麻根际微生物区系失衡，土壤有益菌（芽孢杆菌Bacillus）的菌群数量明显下降，而病原菌青枯劳尔氏菌（Ralstonia solanacearum）和尖孢镰孢菌（Fusarium oxysporum）的含量显著上升，导致了芝麻的连作障碍产生。连作障碍作为现代农业生产中的重大问题，严重制约了我国农业的发展[26]。这种连作效应的产生与其根际微生物的多样性密不可分，而作为常见的一类PGPR——芽孢杆菌在土壤微生态环境中也扮演着重要角色。据报道，大部分芽孢杆菌定植于植物根际后，在植物的生长发育过程中，能与植物逐渐形成复杂的互作关系，包括提供植物生长过程中所需的营养元素，合成一些次生代谢物质，如激素和抗生素等，直接或间接调节植物相关基因表达和根际土壤中其他生物群落结构等，从而促进植物的生长[15]。乔俊卿等[27]发现，枯草芽孢杆菌Bs916能促进番茄植株鲜重的显著增加，在播种15d后，试验组番茄的鲜重达79.8mg，比对照组增长9.61%。本研究定量分析结果发现，怀牛膝根际芽孢杆菌的数量并没有呈现下降的趋势，结合DGGE结果发现，随着连作年限的增加，其群落结构随着连作年限的增加而朝着多样化、数量增多的趋势变化。试验结果还发现怀牛膝连作下会增加枯草芽孢杆菌和耐盐芽孢杆菌的含量，说明了怀牛膝耐连作的关键原因之一可能就是由于根际土壤中有益菌数量随着连作年限的增加而增加。

许多学者的研究都表明，镰刀菌属是最重要的植物病原菌类之一，在全球范围内在诸多作物上都有报道，它能够显著抑制植物的正常生长，导致多种病症，如西瓜枯萎病、大豆根腐病、小麦赤霉病等[28-30]。此外，研究表明，土壤中的镰刀属在侵染的过程中能够分泌次生代谢物-毒素，这种物质会导致植物生理失调、细胞死亡等症状[31]。Zhang等[32]发现造成小麦赤霉病的病原菌禾谷镰刀菌就能产生多种毒素，包括单端孢霉烯族毒素（Trichothecenes）、玉米赤霉烯酮（Zearalenone））、伏马毒素（（FumonisinFB），这些毒素化学性质稳定，受热不分解，不仅造成小麦产量损失，毒素污染更是造成食品安全的重大隐患。对于镰刀菌属的研究，多采用平板分离法和形态学鉴定等方法[33]。然而由于土壤中的真菌许多不能通过室内平板培养法培养，从而造成了对镰刀菌等真菌群落在土壤中的分布描述不准确。变性梯度凝胶电泳（DGGE）通过利用分子标记的方法避开了平板培养法的缺点，更好地了解土壤中镰刀菌属等真菌群落结构的变化[22]。Chen等[34]利用DGGE技术发现太子参的连作下会使得镰刀菌种类，特别是尖孢镰刀菌含量的显着增加。于妍华[35]在对西洋参的研究中发现，Fusarium solani和Fusarium oxvsporum在重茬土壤中为主要优势真菌，并且Fusarium solani对西洋参有较强的侵染作用。与连作障碍不同的是，本研究中发现，怀牛膝连作下并不会导致病原菌镰刀菌的含量增加，连作1～15年的根际土壤镰刀菌的含量没有显著差异。表明怀牛膝连作下土壤并没有恶化，镰刀菌属群落结构也维持着一定的水平，其菌群群体数量没有出现爆发式增长。

综上可知，怀牛膝连作下其根际微生物群落结构向着自身良性方向发展，表现为根际促生菌聚集生长成为优势菌群，同时不同连作年限根际土壤的病原菌镰刀菌属种群数量维持在稳定的水平，这是怀牛膝耐连作的生物学基础。这一结果不仅对于豐富作物根际生态学内容有重要意义，而且对于进一步减缓其他作物连作障碍现象有重要的应用价值。

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（责任编辑：张梅）

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收稿日期：2020-07-28初稿：2020-09-27修改稿

作者簡介：陈婷（1981-），女，博士，助理研究员，研究方向：农业生态学（E-mail： iamchenting@126.com）

*通信作者：林文雄（1957-），男，博士，教授，研究方向：农业生态学（E-mail： wenxiong181@163.com）

基金项目：福建省教育厅中青年教师科研项目（JATl70200）;闽台作物特色种质创制与绿色栽培协同创新中心（2015-75）