碳纳米管固定化纤维素酶的酶学性质

李丽娟 马贵平 夏文静

摘要：纤维素酶在环保型燃料乙醇的生产、中药成分提取、食品、饲料、酿酒、石油开采、环境保护等行业都具有一定的应用前景，但由于纤维素酶的生产成本较高、生物活力较低，使得纤维素酶的应用受到了局限。然而，固定化酶技术可以使酶重复利用，降低生产成本，克服这一技术瓶颈。研究了多壁碳纳米管固定化纤维素酶的酶学性质和重复使用性，并与游离酶的酶学性质做比较。结果表明，固定化纤维素酶的最适温度为50 ℃，最适pH值为3.0，60 ℃放置120 min仍保持70%以上的原酶活力;通过动力学模型研究发现，固定化酶的米氏常数（Km）值为0.588 mmol/L，较游离酶稍有增加;固定化酶于4 ℃下放置1个月，酶活力仍保持原酶活力的68%以上;固定化酶用于连续水解羧甲基纤维素，经过6轮重复使用，固定化酶活力仍保持50%以上。与游离酶相比，固定化纤维素酶具有更宽的温度范围，更好的热稳定性及耐酸碱性，良好的储存稳定性及重复利用性。

关键词：碳纳米管;固定化;纤维素酶;固定化酶;酶学性质;酶活力

中图分类号： S188+.3  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2020）23-0275-04

碳纳米管自1991年被發现以来，由于性质独特[1]吸引人们的关注。碳纳米管是由石墨片卷曲而成的圆柱状结构，报道较多的有单壁碳纳米管和多壁碳纳米管[2]，单壁碳纳米管仅由1层石墨片围绕中心轴卷曲而成，而多壁碳纳米管由许多石墨片围绕中心轴卷取形成[3]。相比于单壁碳纳米管，多壁碳纳米管具有优良的物理化学稳定性，且价格低廉、容易获得、毒性较低、研究应用较多[4-5]。

碳纳米管固定化酶具有比表面积大、载酶量高、分散性好等特点[6-7]，并且碳纳米管与酶长度相似尺寸，有利于二者相互反应[8]。此外，对碳纳米管进行功能化，有利于改变碳纳米管的疏水结构，便于酶的结合，因此表面功能化后的碳纳米管，可为酶提供更加合适的微环境[4]。目前，研究者主要通过共价交联和非共价交联2种方式固定化酶，共价交联方式固定化酶与载体通过共价键进行结合，这种结合较为牢固，但酶的结构容易受到破坏[9];非共价交联方式主要通过π-π堆积作用力、疏水作用力、静电作用力等方式与酶结合，结合力较弱，但对酶的结构影响较小[10]。碳纳米管固定化酶，易于从反应体系中分离，可重复使用，便于运送和储存，稳定性好，生产成本低，有利于工业化应用[11-13]。

微生物产纤维素酶活力较低，而且纤维素酶的生产技术较低，是限制纤维素酶在工业上大量使用的瓶颈之一[14]。本试验通过多壁碳纳米管非共价交联方式固定化纤维素酶，研究了多壁碳纳米管固定化纤维素酶的最适温度、最适pH值、热稳定性、酸碱稳定性、动力学模型、储存稳定性、重复使用性等酶学性质，为纤维素酶广泛应用提供方法。

1 材料与方法

1.1 材料

所用绿色木霉纤维素酶，购自上海瑞永生物科技有限公司，10 U/mg。所用多壁碳纳米管购自深圳纳米港有限公司，外径15～30 nm，长1.5 μm。

1.2 试验时间及地点

于2017年12月至2019年6月在乌兰察布医学高等专科学校生物化学实验室进行试验。

1.3 多壁碳纳米管的功能化

将0.1 g的碳纳米管和100 mL硝酸和硫酸的混酸溶液（体积比为1 ∶ 3），放入容积为200 mL的三角瓶中，之后将其放入超声波清洗器中于40 ℃、40 kHz超声4 h，待充分冷却使碳纳米管沉淀后，去上清，用蒸馏水对沉淀进行分散。通过4 000 r/min离心去上清，反复操作6～7次，直至pH值接近中性为止，于80 ℃真空干燥48 h，冷却干燥24 h，获得功能化的多壁碳纳米管[15]。

1.4 多壁碳纳米管固定化纤维素酶

将20 mg的纤维素酶加入到5 mL pH值为5.0的50 mmol/L柠檬酸-Na2HPO4缓冲液中，再加入 4 mg 的碳纳米管，将上述溶液在水浴箱中40 ℃、200 r/min孵化3 h，3 800 r/min离心12 min后，小心移去上清液，重新分散到柠檬酸-Na2HPO4缓冲液中清洗复合物，重复上述步骤至少4次，移去未结合的酶，将复合物在空气中干燥24 h获得多壁碳纳米管纤维素酶固定化酶[16]。

1.5 纤维素酶活的测定

以羧甲基纤维素（CMC）为底物，采用3，5-二硝基水杨酸（DNS）法测定[17]。吸取pH值为4.8的柠檬酸-Na2HPO4缓冲液1.0 mL和1% CMC 0.5 mL，加入到25 mL试管中，并加入0.5 mL适当稀释的酶液，在50 ℃水浴箱中反应30 min，然后加入3 mL的DNS煮沸5 min，冷却后加蒸馏水定容至25 mL，混匀后在540 nm下比色测定。空白对照以0.5 mL蒸馏水代替酶液。 固定化纤维素酶活力的测定，是将游离酶活力测定中的 0.5 mL 适当稀释的酶液用0.5 mL蒸馏水和一定质量的固定化酶来代替，其余步骤与游离酶酶活力的测定相同。

1.6 温度对纤维素酶活力的影响

将固定化酶和游离酶分别置于30、40、50 、60、70 ℃的水浴箱中，15 min后取出，待冷却到室温进行酶活力测定，以温度为横坐标、相对酶活力为纵坐标作图。

1.7 纤维素酶的热稳定性研究

将固定化酶和游离酶分别置于60 ℃的恒温水浴箱中，每隔5 min取样，待其冷却至室温测定酶活力。初始酶活力为100%，计算酶活力随时间延长而变化的趋势，以时间为横坐标、相对酶活力为纵坐标作图。

1.8 pH值对纤维素酶活力的影响

将固定化酶和游离酶分别加入pH值为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的柠檬酸-Na2HPO4缓冲液中，于40 ℃水浴15 min后取出，以pH值为横坐标、相对酶活力为纵坐标作图。

參考文献：

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