硅、磷配施对水稻镉吸收转运的影响及其机制

曹庭悦，刘鸣达，沃惜慧，李 军

（沈阳农业大学土地与环境学院，沈阳 110866）

镉是一种生物毒性较大的重金属，也是主要的土壤重金属污染物之一[1]。对植物而言，镉不是一种必需的营养元素，镉的摄入会抑制植物幼苗生长[2]，影响植物内酶活性[3]，抑制气孔开放，进而影响光合作用等重要生理过程[4]。水稻作为人类的主要粮食，全球近50%的人口以水稻为食。土壤中的重金属可以被水稻同化，由根部吸收通过茎部运输至籽粒[5]，通过食物链进入人体，是人体摄入镉的主要来源[6]。因此，研究水稻安全生产对于世界粮食安全问题具有重要意义。

硅被认为是对许多高等植物有益的元素。其不仅能够促进植物正常的生长发育，而且能够提高植物对生物和非生物胁迫的抗性[7]。大量研究表明，硅对植物镉毒害具有一定的缓解作用[8-10]。磷是植物生长发育的必需元素之一，对保障作物生长及产量起着不可替代的作用。有研究发现施用含磷肥料在固定重金属方面具有显著效果，可以成为修复重金属污染土壤的一种经济可行的重要措施[11-14]。近年来研究发现，硅、磷配合施入对于抑制植物重金属胁迫具有协同作用。徐应星等[15]通过盆栽试验，研究了硅、磷配合施入对镉胁迫下玉米生物量及其镉吸收量的影响。结果表明，硅、磷配合施入可降低玉米茎叶中的镉含量，且作用效果大于硅、磷单独施入。由此可见，硅、磷、镉三者间交互作用较为复杂，因此，研究三者间的交互作用，对于更好地缓解水稻镉毒害，抑制水稻对镉的吸收，保证水稻的安全生产，降低镉通过食物链对人体健康造成危害具有重要意义。

近年来，对于镉在植物中的分子机制的研究主要集中在镉相关的转运蛋白上，研究发现，水稻根茎间存在影响镉转移的转运蛋白，水稻对镉的吸收和转移受这些相关转运蛋白活性的影响[16-17]。相关基因受水稻生长环境的影响，基因表达量受到调控[18]。Sasa⁃ki等[19]发现OsNramp5是水稻根部内皮层、外皮层以及木质部参与吸收镉的主要转运蛋白，同时影响镉从根部向地上部的运输。重金属ATP酶家族的OsH⁃MA2是一个位于水稻韧皮部的镉转运蛋白，其基因在根中表达强烈，参与镉从根部向地上部的转运[20-21]。LCD是一个与已知基因不同源的新基因，主要在根的维管束和叶片韧皮部的伴胞中表达，与镉在水稻体内的运输和积累有关[22]。OsLCT1是水稻低亲合力阳离子转运蛋白，位于植物细胞的质膜上，参与镉向籽粒的运输，在叶片和茎节中强烈表达[23]。水稻中存在的这些与镉相关的基因，对镉在水稻中的吸收转移具有重要作用。因此，硅、磷的施入可能是通过调控这些基因的表达来减少水稻对镉的吸收、转移和积累。本研究从水稻对镉吸收转运的机制出发，探究缓解水稻镉胁迫的最适硅、磷浓度，并结合水稻镉相关基因的表达，探究施磷影响水稻吸收积累镉的分子机制。

1 材料与方法

1.1 供试品种和试验设计

本试验于室内光照培养箱中进行，采用水培试验，选用圆柱形培养桶，高19 cm，桶口径16.5 cm，桶内放置用于固定植物的定植篮，定植篮深10 cm，每桶装2 L培养液，培养液按照国际水稻研究所配方配制。试验期间，每4 d更换一次培养液。供试品种为沈稻529，由沈阳农业大学农学院提供。

挑选籽粒饱满的水稻种子，用2%的H2O2消毒15 min，用去离子水反复冲洗，放入去离子水中浸种，再将种子均匀洒在育苗盘上，置于培养箱内培育。选取长势均衡的二叶期幼苗，移栽至培养桶中，每桶两穴，每穴5株，采用定植篮固定。使用1/2培养液预培养10 d后换用完全培养液，进行各梯度处理。磷以磷酸二氢钠形式施入，分别设置4个磷浓度梯度处理，分别为0（P0）、60（P1）、180（P2）、360 mg·kg-1（P3），硅以九水合硅酸钠形式施入，设置4个硅浓度梯度处理，分别为 0（Si0）、142（Si1）、284（Si2）、568 mg·kg-1（Si3），每个处理重复3次。与完全培养液混合后用HNO3和NaOH调节pH至5.6，用NaNO3补齐各处理间Na+和NO-3的差异，用于水稻幼苗培养，每天光照13 h，光照时保持室温27℃，停止光照时保持室温23℃，培养15 d后，进行镉胁迫处理，以氯化镉溶液形式进入，浓度设置为5.5 mg·kg-1。镉处理15 d后，收获水稻样品，一部分烘干后用于水稻生物量及镉含量的测定，另一部分保存于-80℃冰箱用于水稻镉转运蛋白基因表达的分析。

1.2 测定方法

1.2.1 水稻生物量的测定

收获水稻样品用去离子水冲洗干净，105℃杀青1 h后继续80℃烘干至恒质量，称量烘干样品质量。

1.2.2 植株各部位镉含量的测定

取烘干样品，粉碎过60目筛，称取各处理水稻样品0.5 g于三角瓶中，以硝酸∶高氯酸=4∶1进行消煮后，用电感耦合等离子体质谱仪（ICP-MS）测定镉的含量，每组重复3次。

1.2.3植株镉转运蛋白基因的表达量测定

取 Si0P0、Si0P2、Si2P0、Si2P2 4个处理水稻样品，其总RNA采用UNIQ-10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒提取，用第一链cDNA合成试剂盒（RevertAid Premium Reverse Transcriptase）逆转录为cDNA。实时定量PCR体系按照SG Fast qPCR Master Mix定量试剂盒的要求配制，并用ABI Stepone plus型荧光定量PCR仪进行分析，反应步骤如下：95℃预变性3 min；95℃变性3 s，60℃退火30 s，60℃延伸30 s，共45个循环；以OsActin基因作为内参基因，采用2-△△CT法[24]计算各处理水稻样品中镉转运相关蛋白基因的相对表达水平，引物序列见表1，每组重复3次。

1.2.4 数据处理

采用Excel 2010进行数据统计和作图，用SPSS19.0软件进行方差分析。采用Duncan法进行各处理间差异显著性检验，不同小写字母代表处理间差异显著（P＜0.05），相同字母代表处理间差异不显著。

2 结果与分析

2.1 硅、磷配施对镉胁迫下水稻生物量的影响

如图1所示，随着硅、磷的施入，水稻生物量总体呈现上升的趋势。当磷施入量不变时，低浓度硅的施入显著增加了水稻幼苗的生物量，在硅施入量为Si2水平时，水稻幼苗的生物量达到最高，较未施入硅处理增加了9.98%。当硅施入量不变，磷施入量为P2水平时，供试水稻幼苗的生物量达到最高，增加了9.74%。当硅、磷配合施入时，水稻幼苗在Si2P2处理时生物量达到最高，增加了27.79%，较空白处理和硅、磷单一元素施入均表现出显著性差异。说明硅、磷的施入有效缓解了镉对水稻生长的毒害，且配合施入效果好于单一元素施入。当硅、磷施入浓度过高时，水稻幼苗生物量增加渐缓，且较Si2P2处理差异不显著，高浓度的硅、磷施入抑制了水稻幼苗生物量的增长。

2.2 硅、磷配施对水稻根部和茎叶部镉含量及根茎转移系数的影响

不同硅、磷水平下水稻根部和茎叶部镉含量的影响如图2和图3所示，由图可以看出，受镉污染胁迫下水稻根部镉含量均高于茎叶部中镉含量，硅、磷的施入显著降低了水稻各部位镉含量。在未有硅施入时，水稻根部和茎叶部均表现出镉含量最高水平，随着磷的施入，水稻根部和茎叶部中镉含量均有降低趋势。根部镉含量降低2.54%～8.45%，茎叶部中镉含量降低5.88%～28.30%，各部位均在P2处理时降低幅度最大，表现出显著性差异。在未有磷施入时，随着水稻硅施入量增加，水稻根部镉含量降低1.13%～3.48%，茎叶部镉含量降低6.28%～18.67%，均在Si2处理时达到最低，但根部未表现出显著性差异。当硅、磷配合施入时，水稻根部及茎叶部镉含量降低幅度较单一元素施入时下降幅度更为显著，均在Si2P2处理时镉含量达到最低，分别降低12.79%和37.91%，较Si0P0处理均表现出显著性差异。说明硅、磷配合施入具有一定的协同作用，较单一元素施入对缓解水稻镉胁迫更为有效。水稻根部与茎叶部总体上表现出相同的降低趋势，茎叶部变化幅度大于根系，说明硅、磷的施入对镉胁迫下水稻苗期茎叶部中镉含量的影响大于根部。但在硅、磷施入量过高时，水稻茎叶部和根部镉含量由降低趋势转为升高趋势，说明硅、磷配施对镉胁迫下水稻镉吸收的缓解作用具有一定的阈值，过多硅、磷的施入对于镉胁迫下水稻镉吸收的缓解作用不显著。

表1 内参及镉转运蛋白基因引物序列Table 1 Internal reference and cadmium transporter gene primer sequence

图1 不同硅、磷水平下水稻的生物量Figure 1 Biomass of rice under different silicon and phosphorus levels

水稻根茎转移系数是指水稻茎叶部镉含量与根部镉含量的比值。一般用来描述重金属从水稻根部向茎叶部的转移能力，转移系数越高，说明水稻根部向茎叶部的重金属转移能力越强。由表2可见，随着硅、磷配合施入浓度的升高，镉的转移系数呈现先降低后增加的趋势。单一元素施入时水稻分别在Si0P2处理和Si2P0处理时根茎转移系数达到最低，分别降低了21.79%和15.60%。两种元素配合施入时，供试水稻品种根茎转移系数在Si2P2处理时达到最低，较未添加硅、磷的处理组降低了28.70%，作用效果好于单一元素施入的作用效果。说明硅、磷的施入增加了水稻根部对镉的固定能力，减少了镉从水稻根部向茎叶部的迁移，且两种元素配合施入时较单一元素施入时对水稻中镉迁移能力的影响更大。

2.3 硅、磷配施对水稻镉相关转运蛋白基因相对表达的影响

图2 不同硅、磷水平下水稻根部镉含量Figure 2 Cadmiumcontent in roots of rice at different levels of silicon and phosphorus

图3 不同硅、磷水平下水稻茎叶部镉含量Figure 3 Cadmium content in stems and leaves of rice at different levelsof silicon and phosphorus

表2 不同硅、磷水平下水稻根部向茎叶部镉转移系数Table 2 Cadmium transfer coefficient fromrice roots to stems and leaves under different levels of silicon and phosphorus

对Si0P0、Si0P2、Si2P0、Si2P2 4个处理组的水稻鲜样进行镉相关转运蛋白基因的表达特征进行分析。由图4可见，相比于Si0P0处理，随着磷的施入，Si0P2处理显著下调了水稻OsLCT1基因的相对表达，下调幅度为49.30%，表现出显著性差异。随着硅的施入，Si2P0处理较Si0P0处理下调幅度为46.68%，表现出显著性差异。Si2P2处理下水稻OsLCT1基因的相对表达量达到最低，较Si0P0处理下调幅度为71.58%，与Si0P2处理和Si2P0处理均表现出显著性差异。各处理组水稻LCD基因的相对表达量表现出与水稻OsLCT1基因相似的变化趋势。在Si0P2处理时该基因相对表达量较Si0P0处理下调27.69%。在Si2P0处理时，该基因相对表达量较Si0P0处理下调幅度为14.32%，表现出显著性差异。在Si2P2处理时水稻该基因相对表达量达到最低，下调幅度为42.05%。水稻OsNramp5基因相对表达量表现出随着硅、磷的施入上调的变化趋势，在Si0P2和Si2P0处理时基因相对表达量上调幅度分别为38.43%和19.96%，表现出显著性差异。在Si2P2处理时基因相对表达量达到最高，上调幅度为81.19%，表现出显著性差异。当磷施入时，水稻OsHMA2基因相对表达未表现出显著差异性，当硅施入时，水稻OsHMA2基因相对表达量下调19.11%，当硅、磷配施时，水稻OsHMA2基因相对表达下调幅度增加，下调幅度为22.44%。随着不同浓度硅、磷的施入，水稻OsLCT1和LCD基因表达受到抑制，OsNramp5基因表达受到促进，OsHMA2基因变化不显著。这种硅、磷对水稻镉转运相关基因表达的影响是硅、磷对水稻镉含量影响的重要分子机制。

图4 不同硅、磷水平下水稻基因相对表达量Figure 4 Relative expression of rice genesunder different silicon and phosphorus levels

3 讨论

硅是植物生长和发育的重要元素，合理施硅可以缓解水稻许多非生物胁迫，降低重金属毒害[25]。磷是植物生长必需的营养元素，可以促进植物生长，增强植物抗逆能力[26]。有研究认为，硅、磷化学性质相似，存在着相互促进的关系。本试验通过对一常规水稻品种进行研究发现，硅、磷配合施入可有效缓解镉对水稻生长的毒害，增加水稻幼苗生物量，在浓度为284 mg·kg-1的硅与浓度为180 mg·kg-1的磷同时施入时，水稻幼苗生物量达到最高。熊丽萍等[27]研究认为，硅的施入可以增加水稻各器官对磷的吸收，进而促进了水稻的生长，水稻总生物量增加。

本试验研究还发现在镉胁迫下，在未有硅、磷施入时，水稻根部及茎叶部镉含量最高，植株受镉胁迫危害最大。硅、磷单一元素的施入均显著降低了水稻根部及茎叶部镉含量，这与一些学者研究结果相似[28-29]。当硅、磷配合施入时，两种元素表现出协同作用，在180 mg·kg-1浓度的磷与 284 mg·kg-1浓度的硅同时施入时，水稻茎叶部与根部镉含量均达到最低，茎叶部下降幅度大于根部，有效抑制了水稻对镉的吸收和转移，且降低幅度高于单一元素施入降低幅度。有研究认为，硅的施入抑制了土壤对磷的固定，增加了土壤磷的有效性，使更多的有效磷被水稻吸收利用，水稻吸收更多的磷与镉离子形成磷酸盐[30-31]，将镉固定在水稻根系中，抑制了镉向茎叶部迁移，缓解了镉对水稻的毒害[32]。也有研究认为，随着硅、磷的施入，水稻植株各部位镉含量降低，是由于硅、磷的施入促进了水稻的生长，增加了水稻生物量，对水稻中的重金属镉形成稀释效应，单位质量中镉含量降低[33]。Siebers等[34]研究认为，磷的施入对于水稻中镉的解毒机制是由于水稻细胞壁中的磷酸根可以与正价镉离子结合，更多地将镉固定在细胞壁中，降低镉在水稻细胞中的迁移速率，硅的施入增加了水稻对磷的吸收，增强了磷对缓解水稻镉胁迫的效果。本研究还发现，硅、磷的施入对于水稻中镉含量的影响具有一定的调节范围，硅、磷施入量过多，水稻中镉含量呈现升高趋势。这与刘芳等[35]研究磷、镉交互作用对烟草吸收积累镉的影响相似，其研究认为，高浓度硅、磷施入后水稻中镉呈现增加的趋势是由于硅、磷的施入促进了水稻根系的生长，增加了根与生长介质间的接触面积，进而增加了水稻根系吸收和积累镉的效率。

本研究发现，随着硅、磷的施入，水稻镉相关转运蛋白基因相对表达受到不同程度的基因调控。可能由于磷素作为核酸、磷脂和ATP等的重要组成成分，参与植物的能量代谢和酶促反应[36]，随着硅的施入水稻吸收磷含量增加，水稻核酸、ATP等生命大分子受到影响，进而影响水稻镉转运相关基因的表达。本试验结果表明，硅、磷的施入通过下调水稻LCD和OsLCT1基因的相对表达量和上调水稻OSNramp5基因的相对表达量，减少镉在水稻中的吸收和转移，且配合施入的调节效果好于单一元素施入。研究表明，低亲和性阳离子转运蛋白OsLCT1是一种主要在叶片和根部表达，参与镉在韧皮部运输的主要转运蛋白[37]。OsLCT1基因表达的下调，可能抑制镉在水稻根部与茎叶部、叶片与籽粒之间的转移，减少镉对水稻籽粒的毒害。水稻LCD基因位于水稻根部维管组织细胞膜，该基因缺失会影响水稻根部对镉的吸收。本试验研究发现，硅、磷施入后，水稻OsLCT1基因和LCD基因呈现的下调趋势，与水稻镉含量变化表现一致。水稻OsLCT1基因和LCD基因的调控可能是水稻硅、磷与镉交互作用的重要分子机制。天然抗性相关巨噬细胞蛋白OsNramp5是定位于质膜、在水稻根部表达、负责根部对锰和镉吸收的主要转运蛋白。促进OsNramp5的基因表达可以抑制镉在水稻中从根部到茎叶部的转移[38]，Ishimaru等[39]研究认为，这种基因调控是通过OsNramp5调控水稻对镉的吸收，进而通过OsHMA2和OsHMA3基因将其进一步转移到液泡中，减少镉对水稻的毒害。本研究发现，磷的施入对水稻OsHMA2基因相对表达影响不显著，可能是由于OsH⁃MA2基因在水稻中影响其表达的机制较复杂。水稻中还存在一些与镉吸收转运相关的转运蛋白，大多数基因在水稻中的调控机制尚不明确，硅、磷的施入是否会对其他镉相关转运蛋白的相对表达造成影响仍需进一步深入研究。

4 结论

（1）硅、磷配合施入有效缓解镉对水稻生长的毒害，增加水稻幼苗总生物量，在284 mg·kg-1浓度的硅与180 mg·kg-1浓度的磷同时施入时，水稻幼苗生物量达到最高。

（2）硅、磷配合施入，有效降低了水稻根部及茎叶部镉含量，当284 mg·kg-1浓度的硅与 180 mg·kg-1浓度的磷同时施入时，水稻根部及茎叶部镉含量达到最低，有效抑制了水稻对镉的吸收和转移，且降低幅度高于单一元素施入时的降低幅度。

（3）硅、磷的施入，有效调控了水稻几种镉转运相关基因的表达，水稻OsLCT1和LCD基因表达下调，OsNramp5基因表达上调，且两者配合施入对3种基因相对表达的调控效果好于单一元素施入调控效果。镉胁迫下，硅、磷有效参与了水稻镉相关转运基因的调控，抑制了水稻对镉的转运，从分子水平上说明了硅、磷配施缓解水稻镉毒害的机制。