福建省稻瘟病菌生理小种组成及水稻主栽品种的抗性筛选

邓云 田大刚 苏妍 张洁薇 吴建文

摘要：【目的】了解近年来福建省稻瘟病菌生理小种组成和福建省主栽水稻品种的稻瘟病抗性情况，可为合理布局抗病品种和稻瘟病抗性育种提供科学依据。【方法】于2017-2019年收集福建省17个县市（地区）的中稻稻瘟病穗颈瘟样本，分离单孢用7个中国鉴别品种进行分类鉴定，并从中筛选出60个福建省内具有代表性的稻瘟病菌株，室内喷雾接菌32个福建省主栽水稻品种，同时用9个稻瘟病抗性基因分子标记检测这32个主栽品种。【结果】7个鉴别品种的鉴定分类结果显示，稻瘟病生理小种ZA群出现频率为39.48%，为优势种群;用60个代表性生理小种室内接菌鉴定结果显示，这些生理小种平均致病率为23 .28%，相对较低，说明福建省推广的主栽水稻品种的抗瘟性相对较好;鉴定筛选出宽抗谱水稻品种15份，其中隆两优华占、两优332的抗谱最广，建议在生产上推广利用。【结论】福建省的稻瘟病生理小种已由早期的以ZB、ZC群为优势种群逐渐转变为以ZA群为优势种群，这与近年来甬优系列品种的大面积推广有关。在抗稻瘟病的品种布局上应优选抗谱宽度大的品种，同时在新品种推广种植中，应追溯宽抗谱水稻品种的致病生理小种来源地，尽量避开可能致使拟推广品种感病的生理小种所在地区。

关键词：稻瘟病;抗性鉴定;抗谱;抗性基因;分子标记

中图分类号：S 43 5.111.4+1

文献标志码：A

文章编号：1008-0384（ 2020） 10-1101-10

0 引言

【研究意义】稻瘟病是我国水稻生产上的主要病害之一，可对水稻产量和品质造成严重的影响[1-2]。我国稻瘟病年发病面积在380万hm2以上，每年因此损失水稻产量达10亿kg[3]。稻瘟病在福建省常年发生，一般年份只在局部地区发生，如果品种感病，又逢有利于发病的气候条件，稻瘟病则大面积发生、流行，对水稻生产造成很大威胁[4-6]。【前人研究进展】种植抗病品种是防治稻瘟病最经济有效且对环境安全的措施[7]，但随着抗病品种的大面积持续推广，寄主的定向选择压力导致自然条件下的稻瘟病菌生理小种不断变异出新的致病型而导致抗病品种的抗性丧失[8-10]。另外，单一系列品种的大面积连续推广，对地区优势生理小种种群及优势生理小种结构都会产生很大的影响。因此，及时掌握稻瘟病生理小种群体变化特征并对其致病力状况进行实时监控，同时了解现有水稻品种稻瘟病抗性情况，有目标地进行抗性育种工作，对于培育广谱持久抗稻瘟病品种至关重要[3]。【本研究切人点】通过采集福建省近期各主要稻区的穗颈瘟标样，分离、筛选出各主要稻区的优势稻瘟病菌生理小种，并进行室内苗期稻瘟病接菌鉴定和抗稻瘟病分子标记检测相结合的方法[11]鉴定福建省主栽品种对稻瘟病的抗性情况。【拟解决的关键问题】掌握近年來福建省稻瘟病菌生理小种的组成和福建省主栽水稻品种的稻瘟病抗性情况，为水稻抗性育种提供理论依据，并讨论如何合理布局抗病品种从而达到防治稻瘟病的目的。

1 材料与方法

1.1 试验材料

2017-2019年，在福建省南平市、武夷山市、三明市、龙岩市区域内的17个县市，采集中稻穗颈瘟样本用于分离稻瘟病菌单孢。

供试的32份水稻品种均为福建省水稻生产上的主栽品种。参试品种为：隆两优1377、沪优9803、梦两优黄莉占、隆两优1988、和两优332、晶两优534、创两优276、甬优9号、微两优898、甬优1540、荟丰优331、丰两优四号、特优009、闽丰优3301、隆两优锋占、隆两优华占、晶两优华占、内5优8015、野香优676、福两优366、深两优5814、浙优18、广两优676、K两优369、君黑糯、君红丝苗、圣丰优319、广优688、两优1269、民优667、科优16、君两优198，品种代号分别用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28，29、30、31、32表示。

1.2 试验方法

1.2.1 单孢分离与接菌鉴定分类 采集穗颈瘟样本，先用75%酒精消毒1 min，再用无菌水清洗，置于灭菌培养皿（内置湿润滤纸片）上无菌培养2～3 d，显微镜下观察长出足够的孢子后，采用孢子振落法进行病原菌株的单孢分离。挑出单孢菌株在淀粉培养基上培养7d后转入装有大麦粒的细菌培养瓶中进行产孢，待菌丝密布大麦粒表面时，用无菌水冲洗去除大麦粒表面菌丝，并用无菌纱布包裹没有菌丝的大麦粒，置于黑光灯下25℃恒温保湿培养2d，用无菌水洗下孢子，制成孢子悬浮液，镜检孢子浓度，孢子浓度需达到1×10⁵个.mL^-1以上[12]。

将7个中国鉴别品种浸种、催芽，2d后播种在水稻育秧盘中，每个品种每穴播15粒，3次重复。待秧苗长至3叶1心时，按每株3 mL的剂量用空压枪喷雾法均匀喷雾孢子悬浮液，接种后黑暗保湿培养24 h，使稻瘟病菌生理小种充分侵染供试品种。接种后14 d内控制温度为15～25 CC，并喷水雾保持湿度，待其充分发病后调查发病状况。病级调查方法按照国际水稻研究所稻瘟病圃苗瘟分级标准进行（表1）。统计时病级与抗性划分标准为：0级为抗（R），1～3级为中感（M），4～9级为感（S）。

根据稻瘟病菌生理小种命名标准[13-15]，采用7个中国鉴别品种：特特普、珍龙13、四丰43、东农363、关东51、合江18和丽江新团黑谷对稻瘟病菌单孢进行分类并对应命名为ZA～ZG群。

1.2.2室内苗期接菌鉴定 在各地区采集并分离的稻瘟病单孢中，选择每个采集点致病力较强（选点原则：采集点的每个地区都要有，福建省抗性鉴定点的菌株多一些）的稻瘟病菌生理小种作为代表性生理小种，于室内鉴定32个水稻主栽品种的抗性。接菌鉴定方法同上。

品种抗谱宽度计算方法：抗谱宽度=1-[（感病生理小种数×2+中感生理小种数×1）/（供试生理小种总数×2）]×100%[16]。

1.2.3抗性基因标记检测 利用9个稻瘟病抗性基因分子标记： Pikp、Pita、Pid3、Pi25、Pi5、Pib、Pit、Pi2、Piz-t检测32个主栽水稻品种的抗性基因。9个稻瘟病抗性基因分子标记引物序列由福建省农业科学院生物技术研究所重点实验室设计研发。

分子标记检测的PCR体系：PCR反应总体积约为20 μL，其中：水稻主栽品种DNA模板1μL，10×PCR缓冲液10μL，Mg2+0.75 μL，正、反向引物各0.5 μL，dNTP 0.15 L，Taq酶0.1 μL，ddH20 7 μL。PCR扩±曾程序：94℃预变性5 min;94℃变性30s、56℃退火30 s、72℃延伸30 s，共设置35次循环;72℃延伸5 min。PCR产物于1%琼脂糖凝胶中电泳检测。

2 结果与分析

2.1 2017-2019年福建省稻瘟病菌生理小种的组成与优势小种的分布

2017-2019年在福建省各主要稻区采集穗颈瘟样本98份，鉴定分离出有效稻瘟病单孢菌株152份，划分为7个群54个生理小种。其中ZA群的菌株出现频率为39.48%，为优势种群;ZB群的菌株出现频率为23.68%;ZC群的菌株出现频率为13.82%;ZD群的菌株出现频率为11.18%;ZE群的菌株出现频率为3.29%;ZF群的菌株出现频率为3.2g%;ZG群的菌株出现频率为5.26%。

2.2 32个主栽水稻品种室内接菌试验的抗性表现

从152个稻瘟病菌生理小种中筛选出60个稻瘟病菌生理小种。将筛选出的60个稻瘟病菌生理小种分别接菌32个福建省主栽水稻品种，接菌结果如表2所示。

2.3 60个稻瘟病菌株的聚类分析结果

利用IBM SPSS Statistics19.0软件对60个菌株的抗性鉴定数据进行聚类分析，结果（图1）表明，在欧式距离（ Euclidean distance）19遗传相似水平处，可以把60个菌株划分为3个遗传谱系（遗传相似组）。在3个遗传谱系中，第1谱系为优势谱系，含有47个菌株，占总数的78.3%;第Ⅱ谱系含有5个菌株;第Ⅲ谱系含有8个菌株。聚类分析与7个鉴别种的分类结果并不存在关联性。

2.4 60个稻瘟病菌株的致病率

由表3看出，60个稻瘟病菌株的致病率为1.56%～67.19%，平均致病率为23.28%。致病率≥50%的生理小种有7个，分别为建阳莒口马伏村的ZAs、建阳童游水尾村的ZBs、三明将乐县的ZAi、三明宁化县的ZD7、邵武外南源乡的ZAi和ZA37、松溪祖墩乡的ZC13，其中：邵武外南源乡的ZA，、ZA37致病率最强，都为67.lg%;50%≥致病率≥20%的生理小种有20个;致病率≤20%的生理小种有33个。表3显示，同一地区分离的稻瘟病菌株致病率不同，不同地区分离的同一生理小种的致病率也不同，例如邵武外南源乡采集的ZA1和松溪花桥乡采集的ZA1稻瘟病菌株的致病率分别为67.19%和9.38%，差异甚大，说明致病率和生理小种的分类并没有显著的相关性。60个稻瘟病菌生理小种平均致病率为23.28%，相对较低，说明福建省推广的主栽水稻品种的抗瘟性相对较强，对大部分稻瘟病菌生理小种的抵抗力较强、抗性频率较高。

2.5 宽抗谱水稻品种的筛选、溯源与应用

通过室内鉴定，从32个主栽品种中筛选出抗谱宽度在90.00%以上的宽抗谱品种15个（表4），进一步追溯这15个宽抗谱水稻品种的致病生理小种来源地（表2），从而分析出这15个宽抗谱水稻品种在省内避免推广的地区。从表4可以看出，每个宽抗谱品种在17个采集点中不适宜推广的地点数一般为0～5个，其中和两优332在采集点范围内均可推广，隆两优华占避免在邵武外南源推广，隆两优1988避免在三明将乐推广。本试验检测的其他水稻主栽品种在福建省内避免推广地区可从表2的抗性鉴定结果中分析获得。

2.6 15个宽抗谱水稻品種的抗病性及抗病基因数量

结合用9个稻瘟病抗性基因分子标记检测32个主栽品种的结果，宽抗谱水稻材料的抗谱及含有抗病基因的情况如表5所示，可供推广品种时参考。15个宽抗谱的水稻品种抗谱为90%～100%，含有的抗性基因数量1～5个，含5个抗性基因的品种有隆两优华占、隆两优1988、晶两优534、隆两优锋占和隆两优1377;含抗性基因数量最少的是民优667，只有1个，抗谱为96.67%。检测结果显示，大多数的宽抗谱品种都含有多个抗性基因。民优667检测出的抗性基因只有1个，估计是因为其含有的其他抗性基因不是本试验检测所用的9个抗性基因。

3 讨论

张学博[17-18]将福建省1975-1985年的稻瘟病菌生理小种分为7个群49个生理小种，以ZB群为优势种群;将福建省1986-1987年的稻瘟病菌生理小种分为7个群25个生理小种，以ZB群、ZC群为主要小种群。黄志鹏[19]将福建省1992-1994年的稻瘟病生理小种分为7个群34个生理小种，以ZB群为优势种群。郑武等[20]的研究显示，1975-1987年、1992-1999年福建省稻瘟病的优势小种群均为ZB群，而2000年的优势小种群则为ZC群。杨秀娟等[21]将2003-2006年福建省的稻瘟病生理小种分为4个群15个生理小种，以ZB群为优势种群。杜宜兴等[22]将2017-2019年福建省稻瘟病生理小种分为6个群20个生理小种，以ZB群为优势种群。阮宏椿等[1]对2012-2015年从福建省闽东、闽南、闽西、闽北和闽中5个主要稻区的丽江新团黑谷上分离获得的347株稻瘟病菌单孢菌株进行分析研究，结果显示：ZA群、ZB群和ZC群为主要种群，出现率分别为27.95%、26.22%和22.19%。本试验采集了2017-2019年福建省内各水稻主产区的稻瘟病菌，分离并鉴定稻瘟病菌的生理小种组成情况，发现福建省稻瘟病菌生理小种的优势种群为ZA群。这一变化说明福建省的稻瘟病菌生理小种优势种群已由早期的ZB、ZC群逐渐转变为ZA群。究其原因可能与福建省近年来大面积推广甬优系列品种有关，尤其是近年来推广的甬优系列品种，如甬优1540、甬优9号等在闽北等水稻主产区推广面积非常大，项目组在各地区随机采样过程中也会采集到较多甬优系列的品种，同时甬优系列品种多数对ZA群表现感病，这就有可能造成ZA群在福建省稻区上升为主要种群。

稻瘟病菌生理小种和水稻抗病品种是一个相互作用相互制衡的体系，抗病品种在同一地区推广3～5年就会因为稻瘟病菌生理小种的变异而导致抗性丧失。因此，抗病品种的推广需要讲究时效性。本研究采集了2017-2019年福建省的穗颈瘟标样，鉴定结果日期较新，对于指导现有主栽品种的合理布局具有现实意义。由于稻瘟病存在小种专化性，在抗稻瘟病的品种布局上应优选抗谱宽度大的品种，抗谱越宽，推广的安全性越高，发病几率越低。今后拟推广品种可以参考本文表2的鉴定结果，并通过追溯宽抗谱水稻品种的致病生理小种来源地，推广中尽量避开可能致使拟推广品种感病的生理小种所在地区。

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（责任编辑：杨小萍）

作者简介：邓云（1981-），女，硕士，高级农艺师，主要从事植物保护与抗病育种（E-mail： 25362663@qq.com）