CRISPR /Cas9基因编辑技术在山羊和绵羊中的应用研究进展

宋绍征 陆睿 张婷 何正义 吴赵曼秋 成勇 周鸣鸣

（1. 无锡太湖学院护理学院，无锡 214000；2. 江苏食品药品职业技术学院，制药工程学院，淮安 223003；3. 扬州大学兽医学院 江苏省转基因动物制药工程研究中心，扬州 225009）

基因编辑技术是指对生物体基因组特定DNA进行精确敲除、定点插入或突变等，使被编辑的生物体性状定向改变且能够稳定遗传的技术，现被广泛地应用于生物医药、基因工程和动植物分子精准遗传育种等领域研究［1-3］。该技术经历了同源重组、RNA干扰、锌指核酸酶（ZFNs）、转录激活因子样效应物核酸酶（TALENs）和成簇规律间隔短回文重复序列/相关蛋白9（CRISPR/Cas9）技术等几代发展。CRISPR/Cas9系统作为一种新型的第三代基因定点编辑技术，只需改变较短的sgRNA序列便可引导Cas9蛋白进行定点精准编辑，相比于其它传统的基因编辑技术，具有简化构建过程、高效、精准、特异等良好特点，受到国内外众多科学研究者的青睐，尤其是在畜牧业遗传育种领域中已成功地用于多种动物的基因改造和物种性状改良［2］。

山羊和绵羊不仅是重要的经济家畜，而且也成为重要的实验动物，国内外早已有羊体细胞克隆和基因修饰的报道，被广泛地应用于生物医学和动物遗传育种等研究领域。由于羊具有性情温顺，肉质鲜嫩，繁殖率高、适应性强的特点，对其进行基因编辑可培育优良品种，提高动物生产性能，获得优质的肉、奶和羊绒等农副产品［3］。CRISPR/Cas9基因编辑技术出现后，便快速地应用于羊的基因编辑研究。本文重点对CRISPR /Cas9基因编辑技术及在羊乳“人源化”改造、提高肉品质、改善绒毛纤维品质等方面的应用研究进展及前景作简要阐述。

1 CRISPR/Cas9基因编辑技术

1.1 CRISPR/Cas9的概述

CRISPR/Cas9是基于古生菌和细菌抵御外来质体或病毒的遗传物质防御系统，该系统中CRISPR相关酶（Cas）在序列识别处可切割外源基因组DNA［4］。用于基因编辑，由sgRNA序列引导Cas9内切酶特异性地识别靶基因位点，从而剪切双链DNA，通过非同源末端连接和同源重组的修复获得基因突变体，是近年兴起的一项新型基因编辑技术，现广泛应用于动植物转基因、基因敲除及基因打靶等个体或细胞组织的基因定点修饰［5-6］。

CRISPR/Cas9系统于1987年，由日本大阪大学的Ishino等［7］在K12型大肠杆菌中发现的一段特殊DNA回文序列，但是当时并未阐释这段序列的功能。2002年，Jansen 等［8］将上述序列正式命名为“成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）”。直到2008年，CRISPR/Cas系统对DNA的精准切割机理才逐渐被人们所认识［9］。2013年，张峰［5］和 Church等［6］首次利用CRISPR/Cas系统介导小鼠和人类细胞基因编辑研究，成功实现了哺乳动物基因组的定点修饰，该技术得到了广泛应用和推崇，连续两年被Science杂志评为“年度十大科学突破之一”。2015年，麻省理工学院McGovern脑研究所和哈佛医学院Broad研究所通过设计改造CRISPR/Cas9基因编辑系统，大大地降低了该系统的“脱靶”效应，CRISPR/Cas9基因编辑系统得到了进一步完善和改进［10］。此后，CRISPR/Cas9系统基因编辑技术迅速成为国内外研究的热点，众多的研究成果被各种相关文献报道和转载［11-14］。

1.2 CRISPR/Cas9的作用机理

CRISPR/Cas系统是由3'端的重复间隔序列（CRISPR）和5'端的编码Cas蛋白操纵子两部分组成［3］。该系统具有切割DNA的能力，分为获取间隔序列、基因座表达、切割外源DNA三个阶段。获取间隔序列阶段是指外源物质入侵细菌时，利用Cas蛋白复合物将外源基因切割加工成一种新的重复间隔序列，从而整合到CRISPR重复序列簇内储存“记忆”。基因座表达阶段是指细菌转录形成precrRNA，反式编码小RNA（tracrRNA）与Cas蛋白相互作用形成双链RNA，进一步被核酸内切酶剪切成为小的成熟RNA（crRNA）。切割外源DNA阶段是指crRNA、tracrRNA和Cas蛋白结合形成三聚复合体，特异性识别PAM序列，从而切割断裂DNA双链，引发机体内基因修复机制［4］。

目前的CRISPR/Cas9系统经人工改造后是一种应用更简单、适用性更广泛的基因编辑技术，由tracr RNA、crRNA 和 Cas9三 种 成 分 构 成［6］。将crRNA和tracrRNA组合为一条嵌合的引导序列RNA（sgRNA），从而进一步简化为仅含sgRNA和Cas9这两部分组成的新型系统，不需要在体外应用RNaseⅢ切割DNA。sgRNA引导Cas9蛋白识别靶标基因片段上的PAM序列，其中一段约20 bp的RNA序列可以和目标基因序列特异互补配对，Cas9蛋白的Ruv C和HNH位点区域分别切割互补链和非互补链，导致DNA双链断裂，再经同源重组或非同源末端连接两种修复途径对发生断裂的DNA双链进行修补，最终实现对靶基因的定向精确编辑功能［10］。

2 CRISPR/Cas9基因编辑技术在山羊和绵羊中的应用

2.1 羊乳“人源化”改造

山羊乳成分更接近人乳，已成为牛奶的重要补充乳品，尤其适用于牛乳过敏症体质者。但是，羊乳中存在β-乳球蛋白（β-lactoglobulin，BLG）等致敏原，能够引起人体过敏反应。羊乳的人源化改造是通过体细胞基因打靶技术，定点敲除基因的同时在山羊BLG基因座中敲入hα-LA或hLF等人营养蛋白的功能基因，既可以去除山羊乳中的过敏原，又能增加羊乳中的营养成分，从而提高羊乳的品质，使其更适合于婴幼儿饮用［11］。利用CRISPR/Cas9系统介导的基因编辑技术可提高BLG基因座定点敲除BLG或用人乳蛋白基因靶向导入的效率，加快乳蛋白基因改造和羊乳“人源化”的研究的进程。

2016年，刘畅［15］在山羊β-酪蛋白基因第二外显子序列中设计了CRISPR/Cas9介导hfat-1基因打靶载体定点导入山羊胎儿成纤维细胞，经G418筛选、PCR检测后共获得45株中靶细胞，打靶效率高达74.29%，明显优于TALENs介导的基因打靶，这为高效编辑羊乳蛋白基因和羊乳“人源化”改造提供了有力的研究价值。2017年，Zhou等［1］利用CRISPR/Cas9系统成功地敲除奶山羊的BLG双等位基因，为羊乳“人源化”改造的分子精准遗传育种提供了可能性；同年，南京农业大学的张艳丽团队［16］利用CRISPR/Cas9系统介导人乳铁蛋白在山羊BLG基因座的打靶研究，高效率地获得了BLG-/hLF+基因打靶细胞株，该项研究主要是针对山羊BLG第一外显子序列设计构建了CRISPR/Cas9载体（pCas9-sg BLG）和BLG基因座的hLF基因打靶载体（p BHA-hLF-NIE），共转染导入山羊耳成纤维细胞中，筛选检测后，成功地获得了大量的基因打靶细胞，打靶效率达到36.69%；值得一提的是，在这项研究中首次利用RAD51蛋白激活剂（RS-1）能够显著地提高外源基因敲入的效率，在今后的工作中值得借鉴。扬州大学动物基因工程实验室利用CRISPR/Cas9这把锋刃的“利器”［17］，在奶山羊BLG基因座定点靶向敲入hLF基因，获得了BLG基因座人乳铁蛋白编码序列定点整合山羊胎儿成纤维细胞系，并用于山羊体细胞克隆。该实验室针对山羊BLG基因第一外显子序列构建sgBLG/Cas9载体，电转染导入山羊胎儿成纤维细胞，以中靶细胞作为体细胞核移植的供核细胞来制备转基因山羊，移植受体母羊后，剖宫产获得3只35日龄打靶克隆胎儿，经鉴定为BLG-/hLF+基因型，并建立了细胞系，打靶效率高达51.4%，这为培育羊乳中富含功能营养成分和低致敏原的转基因山羊新品系提供了实验依据。

由于牛奶的巨大商业应用和在乳品中的地位，也有学者提出对牛奶的人乳化改造。2015年，西北农林科学大学张涌团队［18］首次通过CRISPR/Cas9系统对牛胎儿成纤维细胞β-酪蛋白基因进行编辑，打靶效率为9.7%，这为牛β-酪蛋白基因座定点打靶hLF基因和改造动物乳成分奠定了基础，也为后续羊乳“人源化”改造提供了科学依据。阿根廷学者Alessio等［19］通过CRISPR/Cas9和转座子系统在牛的BLG基因座定点导入多不饱和脂肪酸（ω-3和ω-6）基因，有效地提高了人类食用牛乳的营养价值。

2.2 提高羊肉品质

肌肉生长抑制素（Myostatin，MSTN）基因是一种骨骼肌生长负调控基因，研究表明，哺乳动物中的MSTN 可通过减少肌卫星细胞的更新和肌纤维蛋白的合成，从而限制肌细胞的过度增长，抑制动物骨骼肌的生长［20］。MSTN基因突变可导致动物的成肌细胞数量增加，从而引起家畜的臀、肩、大腿等部位的肌肉群尤其发达而呈现“双肌”性状，这对于提高动物产肉性能具有较高的应用价值，一直是广大育种科研者追求的目标［12］。利用CRISPR/Cas9系统敲除基因部分编码序列或对个另氨基酸的定点精准突变，可以培育出MSTN-/-基因编辑动物，由于该基因的变异而呈现“双肌”表型，达到提高动物瘦肉率、改善肉品质的遗传育种目标。

2014年，连正兴团队［21］利用CRISPR/Cas9系统介导绵羊的MSTN基因靶向修饰，通过胚胎显微注射的方式成功获得了2只MSTN基因突变羔羊，基因编辑的效率为5.7%，这是首例将CRISPR/Cas9系统应用于绵羊MSTN基因编辑；同年，陈创夫等［22］首次将CRISPR/Cas9系统应用于山羊MSTN基因的编辑，通过核移植的方式获得了3只MSTN基因编辑山羊。2015年，Crispo等［12］根据绵羊的MSTN基因位点设计并构建了CRISPR/Cas9表达载体，通过受精卵胞质显微注射的方式获得了22只新生绵羊，经鉴定有10只为MSTN基因突变绵羊，对其性状进行研究发现，MSTN基因编辑绵羊的体重明显大于野生型绵羊，表现出典型的“双肌”表型性状；进一步研究分析，其中有8只为MSTN双等位基因突变羔羊（含5只杂合子），这一研究证实了CRISPR/Cas9可在绵羊上高效敲除MSTN基因，是一种行之有效的基因编辑工具。此后，关于山羊和绵羊的MSTN基因敲除研究不断涌现。2016年，Wang等［23］利用CRISPR/Cas9系统介导获得了MSTN基因编辑绵羊，通过组织切片技术对MSTN基因突变绵羊和野生型绵羊的肌肉组织对比分析显示，MSTN基因敲除能促进绵羊的肌肉生长发育，其肌肉发育程度、肌纤维长度均明显高于普通野生型绵羊。2018年，于鸿浩等［24］和魏海霞等［20］利用CRISPR/Cas9系统介导分别获得了MSTN基因突变山羊和绵羊，且突变效率得到了大大的提高，甚至高达100%编辑效率。Aiello和Patel等［25］利用CRISPR/Cas9系统介导MSTN基因突变也大大地促进了羊肉品质的提高。扬州大学动物基因工程实验室于宝利和梅珺琰等［26-27］根据山羊MSTN基因外显子Ⅲ设计了sgRNA序列，并通过受精卵显微注射的方式成功获得2只MSTN基因突变山羊。经测序比对，一只山羊为杂合子双等位基因突变（一条MSTN基因缺失12 bp，同时替换1 bp；另一条MSTN基因缺失3 bp），而另一只山羊则为单等位基因突变，仅一条MSTN基因缺失26 bp。两只MSTN基因突变山羊胎儿均呈现明显的“双肌”表型，体重和体长显著增加，组织切片显示肌束横截面及肌纤维密度均显著增大。

2.3 改善羊毛纤维品质

随着生活水平的不断提高，人们对羊绒等动物纤维服饰产品的需求也越来越大。绒山羊属于异质毛被，含有初级毛囊和次级毛囊两种，其中次级毛囊生成的毛纤维便是羊绒，属于无髓毛，而初级毛囊生成的则是有髓的粗毛［28］。研究发现，具有调控毛发生长功能的基因主要有成纤维生长因子（Fibroblast growth factor 5，FGF5）和血管内皮生长因子（Vascular endothelial cell growth factor，VEGF）两种，FGF5基因变异或VEGF基因转入可导致毛囊生长期延长，促进毛发生长，从而提高羊绒产量、改善绒品质［28-30］。因此，利用CRISPR/Cas9系统对绒山羊的FGF5和VEGF基因进行定向精准编辑，在绒山羊体内突变FGF5基因和导入VEGF基因将是提高绒山羊产绒量和改善绒毛品质的一种有效的精准分子育种途径。

2015 年，Wang 等［23］通过 CRISPR/Cas9 系统胚胎注射获得了21只FGF5靶向编辑的陕北白绒山羊，对获得的FGF5编辑羊 0-120 d 的绒长性状检测结果表明，FGF5基因靶向编辑的绒山羊的绒毛长度和密度等指标显著高于野生型绒山羊，但此时获得的FGF5基因编辑绒山羊存在脱靶效应。2016年，西北农林科技大学王小龙、陈玉林课题组［29］在绒山羊的毛囊特异性启动子KAP6.1的3'UTR非编码区域设计sgRNA引导序列并构建CRISPR/Cas9载体，与VEGF基因打靶载体共转染绒山羊胎儿成纤维细胞，结果表明sgRNA与Cas9介导VEGF定点敲入效率为15.7%-27.6%，外源VEGF基因有表达功能，且不影响原KAP6.1基因的正常表达，这为后期制备高产优质转基因绒山羊奠定了基础。2017年，Hu等［3］和Li等［13］也应用类似的方法分别获得了FGF基因敲除转基因绵羊个体，进一步加快了CRISPR/Cas9系统在绒山羊基因组中编辑修饰的进程。此外，内蒙古大学刘东军团队［30-31］利用CRISPR/Cas9基因编辑技术于2018年成功地制备了VEGF基因在FGF5和CCR5基因座定点打靶羔羊，在导入促进毛囊生长基因的同时敲除沉默部分不利基因，这为培育产绒量高、品质好的绒山羊新品种提供了科学依据，在改良毛发基因分子遗传育种上起到了一举两得的作用。

2.4 其它相关性状基因的挖掘和应用

由于CRISPR/Cas9系统在动物基因组编辑中显示的巨大优势，育种工作者已将重点锁定在与动物表型相关的功能基因选择作为基因编辑的目标，培育出优良性状的新品种，适应市场需求。目前在绵羊和山羊中已挖掘出了一大批表型相关基因［24］，主要有高原适应相关基因（P53、EPAS1、IFNGR2、MAPK4、NOX4、SLC2A4、PDK1、SOCS2）、毛纤维性状相关基因（FGF5、VEGF、Tβ4、PRL、LCE7A、MOGAT2、MOGAT3、ASIP）、产奶性状相关基因（Casein、α-Lactalbumin、β-Lactoglobulin、ACACA、SCD、LPL、DGAT1、SSCP、gGH、SATA5A）、 沙漠 干 旱 适 应 相 关 基 因（GPX3、ANAX6、GPX7、PTGS2、CPA3、ECE1）、繁殖和生长性状相关基因（BMP15、GDF9、LTBP-1、BMPR1B、B4GALNT2、INHBA、MTNR1B、MSTN）、角型相关基因（RXFP2）、瘤胃功能相关基因（TCHHL2、PRD-SPRRII）等。通过CRISPR/Cas9系统对这些相关基因精准编辑来制备和选育多种性状优良的动物，是羊基因编辑分子育种潜在的研究热点。

刘明军团队［14］利用CRISPR/Cas9 技术成功获得了6只ASIP基因编辑绵羊的研究表明，该基因可作为绵羊毛色筛选的标记基因。Niu等［32］应用CRISPR/Cas9 系统对绵羊和滩羊的ASIP、BCO2和GDF9基因进行编辑的研究，成功地获得了有表型的基因编辑动物个体。内蒙古大学郝斐［33］通过CRISPR-Cas9系统和体细胞核移植技术制备了EDAR基因打靶绒山羊，观察结果显示EDAR基因打靶绒山羊出现头顶没有毛发、皮肤和毛囊异常等特征。南京农业大学郭日红等［34］首次利用CRISPR/Cas9介导敲除山羊CLPG1基因保守位点来研究“美臀”现象，为今后该基因的表达调控机制研究奠定了实验基础。此外，还有Wu等［35］关于Rosa26基因的研究、Zhang等［36］关于fat-1基因的研究和Li等［37］关于Tβ4基因的研究，这些大量的相关基因研究为人们培育优良性能的羊及其它动物的奠定了基础，也为基因编辑分子精准遗传育种提供了可靠的保障。

3 展望

基因编辑技术使人类可以对生物体基因组进行精准的编辑（插入、缺失、突变等），从而定向改变其性状。CRISPR/Cas9系统自问世以来，就有着其它传统基因编辑技术无可比拟的优势，在生物医学和遗传育种领域创造了一批批科研奇迹，更被认为是生物体中最有效、最便捷的基因编辑“利器”［38］。羊是一种重要的经济家畜动物，也是一种常用的实验动物。研究羊的基因编辑对生物制药、基因治疗、物种性状改良等领域具有重要意义。

此外，CRISPR/Cas9系统在羊基因组编辑的其它方面也表现出较大的应用前景。在遗传育种中，CRISPR/Cas9系统基因编辑技术避免了传统育种技术的种间生殖隔离、不良基因连锁以及多代杂交、不可精准控制等局限，可根据需求轻易引入新的优良性状基因，加快育种进程［24］；在基因组学研究中，CRISPR/Cas9系统可对各种基因组序列进行精准的编辑修饰，研究多个基因的协同作用或代偿作用，构建关键基因文库，使功能基因的研究更加简单有效［32］；在疾病动物模型中，通过CRISPR/Cas9系统构建了各种白化病、血友病、帕金森综合症、肺癌、糖尿病、心脏病、精神分裂症以及器官移植相关基因的其它动物模型［39］，这为今后开展羊的相关疾病模型提供了有效途径；在疫病防控中，通过CRISPR/Cas9系统可对羊炭疽病、羊结核病、羊痘等内源致病相关基因进行精准改造，从而预防该疾病的发生；同时，通过基因编辑技术还可以对外源致病细菌或病毒的靶基因进行切割灭活，从而杀灭该细菌和病毒以治疗某些传染性疾病［40］。

目前虽然在羊乳“人源化”改造、提高肉品质和改善毛纤维品质等方面取得了一定的成果，但是，利用CRISPR/Cas9系统在羊的基因编辑研究中还存在一定的局限性。例如，如何避免脱靶效应和嵌合体突变动物的产生；如何提高转基因动物个体的存活率和健康成长率；如何确保转基因遗传育种及转基因副产品的生物安全；如何缩短研发阶段与产业化发展的差距等。因此，这些羊基因编辑相关问题今后有必要进一步研究，扫清障碍。

综上所述，由于CRISPR/Cas9基因编辑技术具有编辑效率高、构建简单、特异性强、精准性高以及序列要求低等独特的优势，深受人们的信赖，为羊及其它动物的遗传育种、基因组学研究、疾病动物模型和疫病防控等方面提供了新的方法和思路。同时，应加大研发投入，充分发挥CRISPR/Cas9系统的巨大潜能，不断优化，争取获得更多振奋人心的研究成果，向产业化和市场化进军，推动社会经济发展。