烟草抗旱相关基因的研究进展

金伊楠，张豪洋，张璐翔，魏烁果，王发展，陈思昂，熊亚南，朱智威，许自成

河南农业大学烟草学院，郑州市农业路63号 450002

干旱胁迫是制约全球农业生产的重大问题之一，据统计全球因水分缺失所导致的作物产量下降的数值，已超过其他因素如盐渍、高温、冷害等造成的作物产量减少数值的总和［1］。植物遇到干旱胁迫后细胞含水率下降，活性氧平衡被打破，细胞膜系统受损，导致植物生长发育迟缓，严重者至死亡［2］。烟草（Nicotiana tabacum L.）是一种重要的种植规模较大的模式植物，近年来广泛地用于抗干旱胁迫的研究［3］。因此，对烟草抗旱胁迫相关基因的研究进展进行了综述，以期为烟草抗旱胁迫研究提供参考。

1 转录因子相关基因

转录因子在逆境胁迫中占有十分重要地位，可以启动或限制参与应激反应的许多下游基因的转录信号转导途径，植物抵御非生物胁迫相关的转录因子家族主要有AP2/ERF、MYB、NAC、WRKY、ZFP 和bHLH 等［4］。

1.1 AP2/ERF 类转录因子

AP2/ERF 类转录因子在植物中分布广泛，参与非生物胁迫中的抗逆信号诱导，通常可分为AP2、DREB 、ERF 和RAV 等［5］。

1.1.1 ERF 类转录因子

乙烯反应因子（ERF）是激活乙烯信号转导途径的关键转录因子，主要参与植物对生物胁迫的反应如发病机制，可与乙烯诱导发病相关基因的启动子中存在的核心GCCGCC 序列结合［6］。

有研究表明，将番茄（Solanum lycopersicum）TERF1 基因导入烟草，可提高转基因植株的抗旱性［7］；WANG 等［8］从麻风树（Jatropha curcas L.）的叶片中分离出1 种新的ERF 型转录因子基因，命名为JcERF2，并将该基因导入烟草，游离脯氨酸和可溶性碳水化合物的积累增加，使烟草的抗旱性增 强；LI 等［9］将 大 豆（Glycine max（L.）Merr.）GmERF5 基因导入烟草，发现该基因参与诱导防御反应和ABA 介导的耐旱途径，使转基因植株对干旱胁迫的耐性提高；吴电云［10］将枸杞（Lycium chinense）LchERF 基因导入烟草，在干旱胁迫下转基因烟草种子萌发率、叶绿素含量显著高于空载体转基因烟草，使其抗旱性增强。

1.1.2 DREB 类转录因子

DREB 是AP2/ERF 类转录因子家族的成员之一，可激活下游基因的表达，并与C-重复脱水反应（DRE/CRT）基因启动子中的顺式作用元件相结合，是植物抗逆境研究领域中的重点研究内容［11］。

刘俊学［12］研究发现，转ItDREB2 基因烟株叶绿素含量增加，SOD、POD 和CAT 酶活性提高，对干旱胁迫的抗性增强；李春瑶［13］从甘蔗（Saccharum officinarum）中分离出SoDREB2 基因，在干旱胁迫下转基因烟草植株细胞膜透性和叶绿素含量高于野生型烟株，并具有较高的抗氧化酶活性，其抗旱性增强；Li 等［14］研究表明，将准噶尔无 叶 豆［Eremosparton songoricum（Litv.）Vass］EsDREB2B 基因导入烟草，转基因植株对多种非生物 胁 迫 的 耐 受 性 提 高；Yang 等［15］从 刚 毛 柽 柳（Tamarix hispida）中 分 离 出ThDREB 基 因，转ThDREB 基因烟草植株抗氧化酶活性提高，活性氧保持在较低水平且易于被清除，其抗旱性增强；Zhang 等［16］试 验 发 现 在 烟 草 中 过 表 达 碱 蓬 草（Suaeda glauca）SsDREB 基因可提高植株叶绿素、脯氨酸和可溶性糖含量，通过激活不同的下游基因，从而提高转基因烟草对干旱和盐胁迫的耐受性；Sharma 等［17］从苹果（Malus domestica）中克隆获得MdDREB76 基因，发现转MdDREB76 基因植株通过诱导抗氧化酶活性而提高其抗旱性和耐盐性；Liu 等［18］将桑树（Morus alba L.）MnDREB4A 基因导入烟草，转基因植株含水率和脯氨酸含量提高，丙二醛含量降低，过表达MnDREB4A 基因显著提高了烟草植株对干旱、冷害、盐和高温胁迫的抗性。

1.2 MYB 类转录因子

MYB 是指含有MYB 结构域的一类转录因子家族，包括1～4 个不完全重复，每个重复有50～53 个高度保守的氨基酸残基，形成螺旋-转角-螺旋的结构［19］。

1993 年Urao［20］首 次 在 模 式 植 物 拟 南 芥（Arabidopsis thaliana）中发现了受脱落酸显著诱导的AtMYB2 基因，并发现MYB 相关转录因子参与对水分胁迫反应基因的调控；Li 等［21］将杜梨（Pyrus betulifolia Bunge）PbrMYB21 基因导入烟草，转基因烟草植株的精氨酸脱羧酶（ADC）表达水平高于野生型，多胺积累增加，表明PbrMYB21 在耐旱性方面发挥了积极作用，原因可能在于该基因调节ADC 的表达而促进多胺合成；Li 等［22］将番茄中的MYB 基因命名为SpMYB，将SpMYB 基因转入烟草后植株丙二醛（MDA）积累减少，SOD 和POD 酶活性提高，苯丙氨酸解氨酶（PAL）积累增加，使转基因烟草植株的抗旱性提高；Wei 等［23］从小麦（Triticum aestivum L.）中克隆了MYB 类转录因子TaODRANT1 基因，导入烟草中发现在模拟干旱胁迫（PEG6000 处理）时相对含水率较高、失水率降低，SOD 和CAT 酶活性较高，离子渗漏和MDA 活性较低，过表达TaODORANT1 基因可上调几种与活性氧（ROS）和应激反应相关的基因表达量，增强转基因烟草植株的抗旱性。

1.3 NAC 类转录因子

NAC 类转录因子是最大的植物特异性转录因子家族之一，与非生物胁迫的耐受性有关［24］。NAC 家族成员一般含有保守的NAC 结构域和一个多样化的C 末端区域，已有研究表明NAC 类转录因子在转录激活中发挥一定作用［25］。

Liu 等［26］从花生（Arachis hypogaea Linn.）中克隆了AhNAC3 基因转入烟草，干旱胁迫下转基因烟草植株的3 种功能基因表达量上调，分别是超氧化物歧化酶（SOD）、吡咯啉-5-羧酸合成酶（P5SC）、胚胎晚期丰富蛋白（LEA），AhNAC3 基因可激活其在细胞核中的特异性靶标，增加活性氧的清除，增强其抗旱性；Wang 等 将番茄SlNAC35基因导入烟草，在干旱胁迫下过表达SlNAC35 可促进烟株根系的生长发育，使抗旱性增强，推测该基因可能与生长素信号转导和调节NtARF基因表达有关；Cao 等［28］研究表明，转橡胶树（Hevea brasiliensis）NAC1基因烟草对干旱胁迫的耐受性提高；Yang等［29］对转甘菊（Chrysanthemum lavandulifolium）DlNAC1基因的烟草进行研究表明，DlNAC1 蛋白定位于细胞核并具有转录激活功能，转基因烟株对干旱和盐胁迫的耐受性显著增强；Liu 等［30］发现在烟草中过表达陆地棉（Gossypium hirsutum L.）GhsNAC3 基因可增强抗旱性和耐盐性，转基因植株初生根较长，鲜质量较大。

1.4 WRKY 类转录因子

WRKY 类转录因子是植物中第二大转录因子家族，在衰老过程中起重要作用，是植物应对非生物胁迫的关键调节因子，因其独特的转录功能而受到越来越多的关注［31］。WRKY 类转录因子通常包含1 个或多个保守的结构域，称为WRKY 域，是一种新型的植物特异性锌指转录调节剂，其N-末端具有高度保守的7 个氨基酸序列WRKYGQK，C端具有1 个C2H2 或C2HC 型的锌指结构［32］。

Li 等［33］对转番茄SpWRKY1 基因烟草进行研究，发现转基因烟株MDA 含量降低，POD 和SOD酶活性提高，叶绿素含量、光合速率和气孔导度增加，并且与应激防御相关基因的表达量增加，转基因烟草对干旱胁迫的耐受性增强；Liu 等［34］对转杜梨PbrWRKY53 基因的烟草植株进行试验，发现在干旱胁迫下活性氧生成量减少，抗氧化酶活性提高，对干旱胁迫的抗性增强，推测可能是通过促进维生素C 的生成而调节了PbrNCED1 基因的表达；Gong 等［35］将金柑（Fortunella crassifolia）FcWRKY70基因导入烟草，使转基因植株对干旱胁迫的耐受性增强；Sun 等［36］将二穗短柄草［Brachypodium distachyum（L.）Beauv］BdWRKY36 基 因 导 入 烟草，转基因植株的离子渗漏和活性氧积累较少，叶绿素含量、相对含水率和抗氧化酶活性显著高于对照植株，从而增强了抗旱性；Chu 等［37］对转陆地棉GhWRKY41 基因烟草的研究表明，GhWRKY41 可以作为气孔闭合的正调节剂，通过调节活性氧清除和抗氧化基因的表达，从而提高转基因烟草的抗旱性。

1.5 ZFP 类转录因子

锌指蛋白（ZFP）是一个数量庞大的转录因子家族，具有高度保守的锌指（ZF）结构域，对基因表达调控起重要作用［38］。根据锌指蛋白保守结构域不同，通常可分为C2H2 型、C8 型、C6 型、指环型和C2HC 型等［39］。

Liu 等［40］从 枳［Poncirus trifoliata（L.）Raf］中克隆PtrZPT2-1 基因并导入烟草，PtrZPT2-1 定位于细胞核，在干旱胁迫下转基因植株存活率、ABA、脯氨酸和可溶性糖含量提高，H2O2积累减少，推测该基因可能通过提高渗透水平从而增强了烟株的抗旱性。

SAP 基因家族的蛋白质具有2 个锌指结构域，即N 端有1 个A20 结构域，C 端有1 个AN1 结 构域［41］，属于AN1/A20 型锌指蛋白。白戈等［42］克隆了烟草NtSAP5 基因，并发现过表达NtSAP5 的转基因烟草植株具有较强抵御干旱胁迫能力，该基因可能是在根对干旱胁迫的响应中发挥作用。

1.6 bHLH 类转录因子

bHLH 是一种多功能转录因子，其蛋白质具有高度保守的（60 个氨基酸序列）结构域，根据功能不同通常可分为基本区域和HLH 区域［43］。基本区域由15 个氨基酸组成，并且作为DNA 结合结构域发挥作用［44］。HLH 区域包含2 个用环连接的α-螺旋，该区域允许形成同源二聚体或异源二聚体。Babitha 等［45］将穇 子［Eleusine coracana（L.）Gaertn］EcbHLH57 基因导入烟草，在干旱胁迫下转基因植株光合作用增强，H2O2和MDA 的积累较少，过表达EcbHLH57 基因可增强应激反应基因的表达，如LEA14、SOD 和APX 等，从而提高了烟草的抗旱性。

2 信号传递相关基因

植物在遭遇非生物胁迫时，首先在受刺激细胞内触发化学信号分子的变化，如水杨酸（SA）、茉莉酸（JA）、脱落酸（ABA）、钙离子（Ca2+）等均被认为是信号传递分子［46］。这些信号分子在浓度和信号强度方面发生变化，并伴随着一系列复杂的信号转换，多种信号组分共同完成植物抵御系统的激活［47］。

2.1 钙依赖蛋白激酶合成相关基因

脱落酸（ABA）可抑制植物生长、促进果实脱落、引起气孔关闭和增强植物抗逆性。Ca2+是ABA 信号通路中的第二信使［48］，当植物受到外界刺激后细胞内Ca2+浓度发生变化，从而形成钙信号［49］。许多传感器可以感知和转移细胞钙信号，其中包括钙调磷酸酶B 蛋白（CBL），可高效地结合Ca2+，但该蛋白缺乏必要的协助结构域，必须与目标蛋白CIPK 结合形成CBL-CIPK 复合体才能传导钙信号，CBL-CIPK 复合体在抗逆境研究中发挥重要作用 。

CIPK 是植物特有的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶［51］。Luo 等［52］发现转二穗短柄草BdCIPK31 基因烟草植株在气孔关闭、离子稳态、活性氧清除和渗透物生物合成方面有积极作用，使其抗旱性增强；Wang 等［53］对过表达TaCIPK2 的烟草植株进行试验，在干旱胁迫下气孔关闭速度加快，失水率降低，MDA 和H2O2含量降低，SOD、POD 和CAT 酶活性提高，TaCIPK2 在转基因烟草植株干旱胁迫响应中起到积极的调节作用。

2.2 水杨酸合成相关基因

水杨酸（SA）是一种可调节抗氧化酶活性的激素类物质，前人的研究多集中在外源施用SA 对植物非生物胁迫生理反应的影响，而对内源SA 在植物防御反应中的调节功能方面的研究仍较少［54］。

SA 具有两个不同的合成途径，即异分支酸合成途径和苯丙氨酸氨裂解酶合成途径［55］。其中催化SA 合成的关键酶包括异分支丙酮酸裂解酶（IPL）、异分支合成酶（ICS）、苯丙氨酸氨裂解酶（PAL）和水杨酸结合蛋白（SABP）等［56］。Li 等［57］将枸杞LcSABP 基因导入烟草，发现LcSABP 转基因植株可通过增加内源性SA 含量而促进活性氧清除，调节相关应激转录因子基因的表达，增强转LcSABP 基因烟草植株对干旱胁迫的耐受性。

2.3 油菜素甾醇合成关键酶基因

油菜素甾醇（BRs）是重要的植物激素，除了参与植物生长发育，还与抵御非生物胁迫息息相关［58］。BRs 合 成 途 径 关 键 酶 有CPD、DET2、CYP85A1 和CYP85A2 等［59］。Duan 等［60］将 菠 菜（Spinacia oleracea L.）SoCYP85A1 基因导入烟草，发现该基因可通过促进根系发育、消除活性氧积累和调节应激反应基因的表达，从而增强转基因烟草的抗旱性；陈永富等［61］研究表明，模拟干旱处理条件下过表达胡杨（Populus euphratica）PeCPD 基因烟草的SOD 和POD 酶活以及可溶性蛋白和可溶性糖含量显著提高，叶片的叶绿素和类胡萝卜素含量高于对照，使转基因植株的抗旱性增强。

3 抗旱功能相关基因

3.1 渗透调节相关基因

3.1.1 甜菜碱合成途径的关键酶基因

甜菜碱是一种具有相溶性的高效渗透调节物质，不仅参与植物渗透调节，还具有非渗透调节的功能［62］。甜菜碱醛脱氢酶（BADH）是甜菜碱合成途径中的关键酶，而烟草自身不能合成甜菜碱，可通过基因工程的方法将甜菜碱和烟草连接在一起 。王贵平 对转BADH 基因烟草的研究发现，在干旱胁迫下转基因烟草植株自身可合成甜菜碱，且叶片的类囊体片层结构受到一定保护, 进而减轻了干旱胁迫对叶绿体超微结构的破坏，叶片相对含水率较高，光合速率维持在较高水平，使抗氧化酶活性提高，可溶性糖含量增加，其对干旱胁迫的耐受性增强。

3.1.2 脯氨酸合成途径的关键酶基因

脯氨酸是一类分子量小、水溶性高的小分子有机化合物。有研究表明，植物细胞中脯氨酸含量增多可增强植物在干旱胁迫时的渗透调节能力，从而增强植物的抗旱能力［65］。△1-吡咯琳-5-羧酸合成酶（P5CS）是脯氨酸合成途径中前两步反应中的关键限速酶。 Kishor 等［66］研究发现，将P5CS 基因导入烟草，转基因植株中脯氨酸含量明显增加，可促进根系生长，植株抵御非生物胁迫的耐受性增强；陈吉宝等［67］对过表达菜豆（Phaseolus vulgaris）PvP5CS2 基因进行研究，干旱处理后转基因烟草植株中脯氨酸含量增加，转基因烟草对干旱胁迫的抗性增强。

3.2 抗氧化代谢相关基因

抗坏血酸（AsA）是一种普遍存在于植物体内的抗氧化物质，GDP-D-甘露糖焦磷酸化酶（GMPase）是AsA 合成途径中的关键酶，其在活性氧清除机制中起关键作用［68］。Ai 等［69］从抗旱、耐盐植物金发草（Pogonatherum paniceum）中克隆了PpGMPase 基因，导入烟草中发现种子发芽率、AsA含量提高，MDA 和H2O2含量降低，过表达PpGMPase 基因的烟草可通过增加AsA 含量来提高对盐和干旱胁迫的耐受性，从而增强植株对活性氧的解毒功能。

CuZnSOD 是植物细胞质和叶绿体中的一种超氧化物歧化酶。Faize 等［70］对过表达CuZnSOD 基因烟草的研究发现，转基因烟草植株水分利用效率和光合速率较高，抗氧化酶活性提高，缓解了干旱胁迫条件下烟株的损伤。

3.3 功能蛋白相关基因

3.3.1 LEA 蛋白

脱水蛋白，也称为第2 组或D-11 家族晚期胚胎发育丰富（LEA）蛋白，是一个高度亲水、富含甘氨酸、热稳定和本质上非结构化的蛋白家族［71］。Bao 等［72］从梅（Prunus mume）中获得了4 种脱水蛋白基因PmLEA10、PmLEA19、PmLEA20和PmLEA29，将其导入烟草后发现外源PmLEAs 基因可增强烟草的抗旱性；杜蕊［73］对转西伯利亚蓼（Polygonum sibiricum Laxm.）LEA 基因烟草的研究发现，转基因植株可溶性蛋白含量增加，细胞脱水减少，光合系统伤害降低，有效提高了转基因植株的抗旱能力。

3.3.2 F-box 蛋白

泛素26S 蛋白酶体（UPS）是细胞内蛋白质降解的主要途径，参与80%以上的蛋白质降解，在植物生长发育中起关键作用［74］。泛素连接酶E3 是UPS 途径中的关键酶，根据E3 连接酶的基序不同可 分为SCF 型、HECT 型、APC 型 和Ring finger型，其中SCF 复合体由Skp1 蛋白、cullin 蛋白、Rbx蛋白和F-box 蛋白组成［75］。F-box 蛋白具有底物识别的功能，对植物的抗逆性研究有重要意义。

Zhou 等［76］将小麦TaFBA1 基因导入烟草，发现转基因烟草植株发芽率、相对含水率和净光合速率较高，抗氧化酶活性较高，转基因植株的抗旱性增强；Kong 等［77］研究表明，小麦F-box 蛋白基因TaFBA1 的过表达可以改善转基因烟草植株对干旱胁迫的耐受性，并且植株活性氧积累较少，MDA 含量较低，抗氧化酶活性水平提高，抗氧化相关基因的表达上调。

3.3.3 热休克蛋白

热休克蛋白（HSPs）是植物受到热量或其他因素的刺激时，产生的一种高度保守的应激蛋白［78］。根据分子量的不同可分为5 种类型，HSP100/ClpB、HSP90、HSP70/Dna、小热休克蛋白（sHSP）和伴侣蛋白（HSP60 / GroEL）［79］。其中HSP90 蛋白家族是真核生物细胞质中广泛存在的分子伴侣，具有高度保守性。Song 等［80］对烟草NtHSP90 基因家族进行研究，鉴定出21 个NtHSP90，并根据系统发育分析将其分为11 类（NtHSP90-1 至NtHSP90-11），其 中NtHSP90-4、NtHSP90-5 和NtHSP90-9 的表达受干旱胁迫的诱导而上调。

HSP70 具有促进蛋白质折叠、生物膜之间多肽的移动和降解错误折叠蛋白的功能，但HSP70蛋白不能单独作用，还需要与调节蛋白Dna J 和Grp E 共同作用［81］。李军旗［82］对烟草NtDnaJ1 基因在干旱胁迫下的功能的分析发现，NtDnaJ1 基因主要在叶和花中表达，且受干旱胁迫的诱导，过表达NtDnaJ1 基因的烟草植株抗旱性增强。

3.3.4 脂质转移蛋白

脂质转移蛋白（LTPs）是分子量小的分泌蛋白，因其具有亲和性，又称为非特异性脂质转移蛋白［83］。根据分子量大小LTPs 通常可分为3 类，LTP1、LTP2 和LTP3［84］。Xu 等［85］对 过 表 达 烟 草NtLTP4 基因的烟草的研究发现，过表达植株活性氧清除酶的表达水平与活性提高，可通过降低蒸腾速率而增强烟草对干旱胁迫的耐受性。

4 展望

干旱胁迫是非生物胁迫中的重点研究领域，而烟草作为重要的模式植物和经济作物，一直以来都是学者们关注的热点。随着研究者们对烟草抗干旱胁迫方面的研究不断扩展和深入，目前，已对几类重要的转录因子家族、植物生长激素、植物生长调节剂和功能蛋白等方面的基因进行研究，并取得很大进展，但是仍存在一些问题：①在烟草抗旱相关基因的研究中，重心大多集中在其他植物抗旱基因在烟草中的应用，烟草自身与抗旱相关的基因还有待进一步发掘与深入研究。②基因工程已经成为植物抗旱性研究的重要手段，但是大多数研究仅涉及将外源基因导入烟草并进行功能验证，只有少数研究涉及基因敲除技术，尚未有研究涉及抗旱胁迫突变体等方面。③目前研究大多停留在转基因植株的生理指标测定，而对植物响应干旱胁迫的机制尚不明确，尤其是对外源基因转入烟草后的作用机制尚不清楚。④抗旱相关基因仍有待发掘，缺乏系统的资源数据库对现有研究进行归纳整合。⑤大多研究是在模拟干旱条件下进行，如何使研究成果更加高效且有效地应用于生产实践。

针对上述的问题，在未来的研究中可利用免疫共沉淀、酵母双杂交和DNA 分子标记等分子技术，揭示烟草抗旱相关的转录因子和信号转导途径；全面综合分析烟草对干旱胁迫的响应机制，建立科学、有效的烟草抗旱基因数据库和评价体系；运用分子育种弥补传统育种的欠缺，提高育种水平；将实验室室内试验与田间试验相结合，寻找可有效服务于田间种植的抗旱方法。此外，还可运用基因芯片、基因沉默和酵母双杂交等分子生物学技术深入研究并发掘出更多新的抗旱基因。