菌落的等效性模拟及标准物质研究

2020-02-19黄彦捷周瑾艳吴向垒黄敏晗许俊斌罗旭东

计量学报 2020年1期

陈玲，黄彦捷，周瑾艳，吴向垒，黄敏晗，许俊斌，罗旭东

(广东省计量科学研究院广东省现代几何与力学计量技术重点实验室，广东广州 510405)

1 引言

科研和检测领域常用菌落计数器检验食品、卫生用品、临床标本中细菌数量，需要标准物质对其测量结果的一致性、准确性及可比性进行评价。然而菌落本身是不稳定的，不方便携带，不适合用作菌落计数器计量校准用标准物质。

菌落是指在固体培养基上生长，可以用肉眼识别的，由成千上万相同的细菌组成的生长物。菌落的大小和形态和菌种息息相关。当样品被稀释到一定程度并与培养基混合，在一定的培养条件下，每一个能够生长繁殖的细菌细胞都能在培养基上形成可见的菌落[1]。菌落总数就是指在一定条件下每克(每毫升)样品生长出的菌落总数。菌落总数测定可以用来判定食品被细菌污染的程度及卫生质量，反映了食品在生产过程中是否符合卫生要求[2,3]。菌落数量、大小和形态标志着食品卫生质量的优劣[4，5]。

在日常检验和科研领域，通常使用光学显微镜或是菌落计数器对菌落的大小、形态、边缘、表面、质地、颜色等性质进行分析[6,7]。其中菌落计数器广泛用于食品、卫生用品、临床标本中细菌数量的检验。目前该仪器在各级卫生防疫站、环境检测站、食品卫生监督检查所、化妆品和药品检验实验室、医院、大专院校及科研单位中被用于微生物菌落计数、抗生素抗菌性测试和菌种筛选等;然而在广泛的应用背景下，各仪器之间测量结果是否一致、可比，是否可以实现量值溯源就很大程度上影响到了仪器测量结果的有效性、可靠性和准确性，因此亟需通过稳定可溯源的标准物质实现对各类菌落计数器的计量校准[8～12]。

但是由于真实菌落的体系复杂、稳定性差，很难用来做标准物质进行量值溯源传递和分析方法评价。现有的评价方法往往不尽如人意。吴玉峰等[13]选取两位长期从事微生物检验工作的专业人员采用双盲法对水样中的菌落总数计数，取两人计数值的平均数，与该仪器分析结果进行对比验证;利用该方法，虽然每次可以通过平板计数法人工计数来验证菌落计数器测量的准确性，但无法评价仪器精密度，且存在人为因素所产生的偏差。张春晨等[14]则采用枯黑芽孢制备菌片管，随意抽取10%的样品进行检测，制作质控图；但由于枯黑芽孢是生物活体，其菌落本身不稳定，且不便携带，不适合做菌落计数器的质控物。

根据菌落计数器的应用，结合菌落的培养生长特性，借鉴计算机图像法设计[15]，采用功能等效的模拟菌落作为标准物质，就可以实现菌落计数器的精确校准、分析方法的有效评价以及分析质量的精密控制。本文报道的模拟菌落标准物质(bacterial colony by plane)包括了用于校准菌落计数器示值误差和示值重复性的模拟菌落总数的标准物质和一种用于校准菌落计数器鉴别力的模拟菌落大小的标准物质。模拟菌落总数标准物质有4种，分别为36 CFU、120 CFU、180 CFU和290 CFU(CFU是colony-forming units的缩写，菌落形成单位，指单位体积中的细菌群落总数)。模拟菌落大小的标准物质用影像测量仪进行了准确定值，扩展不确定度为0.024 mm。

本文系统地介绍了标准物质原材料的选择、特性量值的测量方法、标准物质的制备方法、均匀性检验、稳定性考察以及定值过程[16];对模拟菌落标准物质的稳定性进行了12个月的考察，证明该标准物质是稳定的。该系列标准物质量值准确，均匀性、稳定性良好，使用方便，已通过国家二级标准物质评审，编号为GBW(E)130586～GBW(E)130590，有望作为量值传递的标准在生物、食品分析评价领域发挥重要的作用。

2 实验部分

2.1 仪器

Prismo Navigator 795 HTG影像测量机。影像测量机在使用前，首先用3等3级量块和物镜测微尺对所使用的仪器进行检定，确认仪器处在正常的工作状态，并保证仪器测量的溯源性。

2.2 标准物质的制备

2.2.1 图案设计

采用AutoCAD设计，根据实际使用情况，设计相应的菌落模拟图形。将模拟菌落最终成像在直径为9 cm的膜片上。实际制作时，每批标准物质，每个图形都成像500片，即每种标准物质制作500份。

2.2.2 结构设计

使用高分辨率光绘机在感光胶片上根据模拟菌落图形进行曝光制作。采用高透光聚碳酸酯(PC)材料印刷银盐，构成模拟菌落标准物质的膜片。膜片包括保护层、影像层、粘结层、片基、防光晕层和防静电层(结构如图1所示)。

其中保护层含有紫外线吸收剂，为明胶薄膜，用于防止影像层所承载信息受光照而褪色以及保护影像层免于划伤；影像层表面设有多个不透明斑点，不透明斑点采用银盐印刷技术固着于影像层表面，以斑点模拟菌落；影像层与片基通过粘结层相互粘连；片基为高透光透明的聚碳酸酯材料，作为校准装置的载体基材；防光晕层由吸光物质、粘合剂组成，能吸收产生光晕的有害光线；防静电层中含有防静电剂以避免静电聚集。

2.3 标准物质样品定值

共选取2种特征量值对菌落进行生物等效性模拟，分别为菌落总数及菌落大小。

2.3.1 模拟菌落总数标准物质的定值

采用人工识别计数的方法，计数结果即为标准值。为消除测量时的个人差异，由实验室6名实验人员对3个膜片样品进行计数，取平均值为定值结果。计数时，将小的菌落放在视线的左上方;同时，为避免设计值的主导，应使实验人员保持对设计值的未知状态。

2.3.2 模拟菌落大小标准物质的定值

随机抽取10个膜片样品，每个样品采用影像测量机直接进行测量，每个样品测量3次，剔除异常值后，取10个样品测量结果的平均值为最终定值结果。

2.4 均匀性检验

标准物质的均匀性是衡量标准物质性能的一个重要指标，也是标准物质量值能准确传递的物质基础。随机抽取一定数量的样品，采用精密度高的实验方法进行测定;采用方差分析法来统计检验样品的均匀性;该方法是通过组间方差和组内方差的比较来判断各组测量值之间有无系统性差异，如果二者的比小于统计检验的临界值，则认为样品是均匀的。

2.5 稳定性检验

标准物质的稳定性是指被定值的特性量随时间变化的情况，标准物质的稳定性受物理、化学和保存条件等因素的影响。需要用精密度高的分析方法对其进行长时间的定期考察来确定相对的稳定期限。依据标准物质技术规范，本着前紧后疏的原则，对模拟菌落标准物质的稳定性进行了考察。每次随机抽取3个样品，每个样品上进行菌落总数计数或是取6个大小一致的菌落，在不同的时间间隔内进行比对测量,各量值测量3次取其平均值进行稳定性分析。

3 模拟菌落总数标准物质

通过等效性模拟菌落标准物质的两个重要参数为菌落总数和菌落大小，运用菌落计数器可以实现菌落数量的统计以及菌落大小的观测。

3.1 图形设计

依据GB 4789.2—2016《食品微生物菌落总数的测定》，一般选取30～300 CFU之间的平板进行菌落计数[17]，设计了模拟菌落总数分别为36 CFU、120 CFU、180 CFU和290 CFU的4种菌落总数标准物质，其图案如图2所示。其中，模拟菌落总数标准值为36 CFU和120 CFU的2种标准物质被设计为均匀大小，代表菌落均匀分布，大小基本一致，约为3.180 mm。考虑到实际检测中会碰到菌落大小不一并出现粘连的情况，因而设计的模拟菌落总数标准值为180 CFU和290 CFU的2种标准物质，其菌落大小不一，分布不均匀，且模拟了典型的粘连情况。其中180 CFU标准物质的菌落直径范围为0.482～4.189 mm，290 CFU标准物质的菌落直径范围为0.407～3.193 mm。

图2 模拟菌落总数标准物质俯视图Fig.2 Top view of the simulated bacterial colony counts reference materials

3.2 菌落总数的定值

由于设计的模拟菌落总数标准物质有良好的保护层，加工过程中也不会对模拟菌落个数产生影响,因而利用膜片设计的菌落总数均和每次实验人员计数结果相一致，均为设计值，分别为36 CFU、120 CFU、180 CFU和290 CFU。

3.3 均匀性及稳定性检验

当分别从每种已经编上号码的菌落总数标准物质中按照头尾、中间编号随机抽取15个样品，目测识别计数时，模拟菌落总数计数也为设计值，说明该系列标准物质均匀性良好。

当每次随机抽取3个样品，在不同的时间间隔内进行比对测量，发现在长达12个月的观察时间内，模拟菌落总数计数均为设计值，说明该系列标准物质稳定性良好。

3.4 不确定度分析及最终定值

根据JJG 1006—94《一级标准物质技术规范》的规定[18]，标准值的总不确定度由3部分组成: 第1部分为定值的标准不确定度分量ud，第2部分是不均匀产生的不确定度分量uj，和第3部分不稳定产生的不确定度分量uw。

根据模拟菌落总数的定值数据，不同实验人员得到的定值数据是一致的。均匀性和稳定性考察结果表明，2种实验条件下引入的不确定度分量可以忽略不计。但在使用过程中，可能由于使用磨损导致标准物质中直径较小的标准物质识别不清，导致总数减少; 或者标准物质的拉划损坏导致上机识别计数时菌落总数增加。

以总数为180 CFU的模拟菌落总数标准物质为例，磨损可能导致最小的1个菌落计数时模糊，故由此引入的不确定度为：

因此，模拟菌落总数标准物质的相对扩展不确定度为：

Urel=0.55%×2=1.1%

4种模拟菌落总数标准物质的最终定值结果为：

36 CFU:Urel=1%,k=2；

120 CFU:Urel=2%,k=2；

180 CFU:Urel=2%,k=2；

290 CFU:Urel=2%,k=2。

3.5 实际应用

该系列模拟菌落总数标准物质已获得国家二级标准物质认证，编号为GBW(E)130586～GBW(E)130589，并且已经应用到了检测和科研领域菌落计数器的实际校准当中。图3是利用模拟菌落总数为180 CFU的菌落总数标准物质对某品牌菌落计数器校准时的成像结果，仪器可以识别所有模拟菌落，实现对计数结果的准确评估。

图3 模拟菌落总数标准物质用于仪器校准结果Fig.3 The result of calibration using the simulated bacterial colony counts reference materials

4 模拟菌落大小标准物质

4.1 图形设计

根据市面上常见的菌落计数仪示值分辨力一般不大于0.4 mm，即可以识别最小菌落的直径不超过0.4 mm，设计了图案如图4所示的模拟菌落大小的标准物质，模拟菌落总数为120 CFU，图案中包含了0.1～5.0mm直径范围的模拟菌落，也涉及到了常见的2个或多个菌落的粘连情况模拟。利用影像测量仪进行了精确直径定值，特性值如表1所示。需要说明的是图4中菌落的位置与表1中的数值一一对应，表1中以从上端开始的各行中的左数位号表示，如3-1表示第3行中左数第1个模拟菌落，4-6表示第4行中左数第6个模拟菌落。

图4 模拟菌落大小标准物质俯视图Fig.4 Top view of the simulated bacterial colony sizes reference materials

4.2 菌落大小的定值

由于设计的模拟菌落总数标准物质有良好的保护层，加工过程中也不会对模拟菌落大小产生影响,因而菌落大小尺寸均接近设计值，共含有120种不同直径的菌落，具体结果见表1。

在均匀性、稳定性及不确定度分析时，为简明起见，将以模拟菌落的1个代表性尺寸的分析为例来说明。

4.3 均匀性检验

从已编号的500份标准物质中按照头尾、中间编号随机抽取15个样品，以大小为2.681 mm(6-2位置)的模拟菌落为代表;用影像测量机进行定值测量，每个菌落测量3次，取平均值作为均匀性评价的测量结果。测定结果如表2所示。

表1 模拟菌落大小标准物质特性量值及标准偏差Tab.1 The value and standard deviation of the reference materials stimulated bacterial colony sizes mm

表2 模拟菌落大小标准物质均匀性检验Tab.2 The homogeneity of the simulated bacterial colony sizes reference materials mm

95%的置信概率下采用方差分析考察样品的均匀性[19,20]，计算结果表3所示。表中：SS为标准方差；df为自由度；MS为平均方差；F为F值；Sig.F为F的临界值。由表3中数据可得：

Sig.F=Fα(14,30)=2.04,α=0.05

(1)

表3模拟菌落大小标准物质均匀性结果方差分析
Tab.3The Homogeneity and variance analysis results of the simulated bacterial colony sizes reference materials

差异源SSdfMSFSig.F组间2.91×10-4142.08×10-51.512.04组内4.14×10-4301.38×10-5总计7.05×10-444

均匀性产生的标准偏差SH可由式(2)和式(3)求得。

=2.333×10-6

(2)

(3)

4.4 稳定性检验

每次随机抽取3个样品，每个样品上取6个大小一致的菌落，在不同的时间间隔内进行比对测量，仍旧以大小为2.681 mm(6-2位置)的模拟菌落为代表，测量3次取平均值进行稳定性分析，具体数据如表4所示。因没有一种物理/化学模型能够真实地描述该候选标准样品的稳定性变化机理，故采用直线作为经验模型。

将表4中数据，以x代表时间，以y代表菌落直径，拟合成一条直线，利用评估最后的回归方差来判断样品的稳定性。

表4 模拟菌落大小标准物质稳定性实验Tab.4 The stability of the simulated bacterial colony sizes reference materials mm

由分析数据得到线性模型的斜率为：

(4)

则线性方程的标准偏差：

(5)

S=4.59×10-3，则斜率的不确定度：

(6)

在自由度为n-2和p=0.95(95%置信水平)时，查表得t因子等于2.75

t0.95,n-2·S(b1)=2.75×4.75×10-4

=1.31×10-3

(7)

经计算可得|b1|

4.5 不确定度分析

模拟菌落大小的不确定度来源包括定值引入的不确定度、均匀性引入的不确定度、稳定性引入的不确定度以及温度变化引入的不确定度。

4.5.1 定值引入的不确定度

定值采用影像测量仪，故模拟菌落直径定值不确定度来源包括影像测量仪测量引入的不确定度和仪器测量重复性引入的不确定度。

影像测量仪的测量不确定度：一是平台移动的示值误差引入的不确定度，二是镜头误差引入的不确定度。平台移动误差根据仪器的校准为±1 μm，引入的不确定度为

镜头误差引入的不确定度包含尺寸测量误差即长度测量误差引入的不确定度和圆度测量误差即镜头的畸变引入的测量不确定度。

尺寸测量误差根据校准证书为±1.5 μm，由此引入的不确定度为：

合成上述不确定度分量，由影像测量仪测量引入的不确定度为：

=0.001 4 mm

(8)

重复测量10次大小为2.681 mm的模拟菌落尺寸，测量值分别为：2.6759 mm，2.6813 mm，2.6864 mm，2.6843 mm，2.6817 mm，2.6784 mm，2.6773 mm，2.6718 mm，2.6738 mm，2.6809 mm。10次测量值的标准偏差为0.004946mm，则示值重复性引入的不确定度为：

定值引入的不确定度为：

=3.13×10-3mm

(9)

4.5.2 均匀性产生的标准不确定度

根据均匀性检验部分的计算结果看，不均匀性所产生的标准偏差需要合成到定值最终不确定度中。故样品间不均匀的标准偏差：

uj=SH=1.53×10-3mm

(10)

4.5.3 稳定性引入的不确定度

采用评估稳定性的回归方差分析表来进行估计标准不确定度。有效期t为 12个月的长期稳定性的不确定度贡献为：

uw=S(b1)·t=0.000 475×12 mm

=5.70×10-3mm

(11)

4.5.4 温度变化引入的不确定度

塑料的膨胀系数为1.8×10-4mm/K，存放或运输环境温度变化为±20 ℃，因此温度变化引入的不确定度分别为：uT=2.681×1.8×10-4×20 mm=9.65×10-3mm。

4.5.5 合成不确定度

=[(3.13×10-3)2+(1.53×10-3)2+

(5.70×10-3)2+(9.65×10-3)2]1/2mm

=1.17×10-2mm

(12)

取k=2，按不确定度计算中的最大值，则扩展不确定度为:U=1.17×10-2×2 mm≈0.024 mm。其余119个模拟菌落的不确定度也包含上述4种不确定度分量，计算过程就不在本文中叙述。该模拟菌落大小标准物质已获得国家二级标准物质认证，编号为GBW(E)130590，具体参数可查询相应标准物质证书。