MicroRNA调控Th17/Treg平衡的研究进展

郑 雅综述，雷 浪审校

0 引 言

CD4+T细胞亚群的平衡与抵抗病原体、防止应激反应密切相关，对于维持免疫耐受和参加肿瘤免疫反应有重要作用[1]。CD4+T细胞亚群能够相互转化，在适当的环境下发挥不同的作用[1]。目前已知的CD4+T细胞亚群包括T辅助性细胞1 (T helper 1 cells, Th1)、T辅助性细胞2 (T helper 2 cells, Th2)、T辅助性细胞17 (T helper 17 cells, Th17)、T滤泡辅助细胞 (T follicle helper cell, Tfh) 和调节性T细胞 (regulatory T cell, Treg)[1]。T细胞亚群比例的失衡会导致自身免疫性疾病的发生发展。近年来对自身免疫性疾病和炎症性疾病的免疫病理学研究发现，Th17和Treg是疾病发生发展的重要参与者[2]。Th17细胞能够促进炎症的发生，过量存在时促进自身免疫和组织损伤；Treg具有拮抗作用，当其缺陷也会导致相似的疾病[2]。因此，对Th17/Treg平衡的研究可有助于了解自身免疫性疾病和慢性炎症的发病机制并提供理论依据。

微小RNA (microRNA, miRNA)对哺乳动物免疫系统的调控作用表明，miRNAs的基因消融以及某些单个miRNA的缺失或失调会严重影响免疫细胞的发育和功能，导致自身免疫病或肿瘤免疫性疾病[3]。最近研究表明多种miRNA对Th17和/或Treg具有调控作用。本文回顾国内外的文献报道，探讨Th17/Treg平衡与miRNAs的相关性。

1 Th17和Treg概述

1.1 T淋巴细胞T淋巴细胞是淋巴细胞的主要组成成分，在胸腺中由淋巴干细胞分化而来，发育成熟后通过血液和淋巴系统分布全身，在免疫和抗癌治疗中发挥重要作用。T淋巴细胞在未接触抗原刺激前处于相对静止状态，称为初始T细胞(naive T cell ,Tn)；通过抗原刺激或树突状细胞的递呈作用后，可进一步分化为不同的T细胞，发挥多种生物学功能，如直接杀伤靶细胞，产生细胞因子，对特异性抗原的应答反应等。

T淋巴细胞按照功能和表面标志可以分为4类：①细胞毒性T细胞，表面标志为CD8，能够产生特殊的抗原反应从而“杀死”侵入的目标细胞；②辅助性T细胞(helper T cell)，表现为CD4阳性，能够“辅助”其他淋巴细胞发挥作用；③调节性T细胞(regulatory T cell，Treg)，表面标志主要是CD4，能够维持自身耐受以及避免过度的免疫反应而导致机体损伤；④记忆性T细胞，没有特异的表面标志物，在特异性抗原刺激作用下存活时间更长。

本研究主要针对CD4+T细胞，在不同细胞因子和环境的作用下可以分为4类功能不同的细胞：①Th1，参与细胞免疫和迟发性超敏反应，能够加强宿主对病原微生物特别是病毒和胞内病原体的免疫防御；②Th2，参与体液免疫能够辅助B细胞发挥功能；③Th17，是能够产生白细胞介素-17(interleukin 17，IL-17)的细胞亚群，与炎症反应和自身免疫性疾病的发生发展密切相关；④ Treg，目前已知唯一能够抑制宿主过度免疫反应的细胞[1-2]。

1.2Th17细胞2005年发现Th17细胞是小鼠分泌IL-17的细胞，其后许多研究者将其作为研究重点，提出Th17细胞在多个人类疾病中发挥着重要作用，包括参与各种自身免疫性疾病、过敏性疾病和肿瘤免疫的发生发展，以及器官和骨髓移植引起的免疫排斥[2, 4-6]。

受到抗原刺激后，幼稚CD4+T细胞被激活后可以增殖、分化为不同的效应细胞，产生不同的功能。在IL-6和转化生长因子-β (transforming growth factor β, TGF-β) 的作用下，幼稚CD4+T细胞能够分化成一类能产生IL-17但是不产生干扰素γ (Interferon-γ, IFN-γ) 或IL-4的T细胞，命名为Th17细胞[5-6]。有研究认为，人Th17细胞的分化不同于小鼠的Th17细胞，并不依赖于TGF-β，甚至TGF-β会抑制Th17细胞的产生。但是，这些研究中的T细胞是从外周血中分离提纯的Th细胞，并没有控制来自血清或血小板中的内源性TGF-β[7-8]。随着对Th17细胞研究的逐渐深入，多数研究中认为Th17细胞的发育不同于Th1、Th2和Treg。不同于小鼠，人Th17细胞的发育特征在于需要独特的转录因子如TGF-β结合IL-6、IL-21、IL-23和IL-1β。在分子水平上，Th17细胞的分化需要特异性转录因子如类维生素A相关孤儿受体C (retinoic acid-related orphan receptor C, RORC) 的诱导[9]。

Th17细胞可以分泌促炎细胞因子，包括IL-17A、IL-17F、IL-21和IL-22，募集并激活中性粒细胞和巨噬细胞以对抗细胞外微生物或介导自身免疫性疾病的发展[10]。Th17细胞或其产物与许多人类炎症和自身免疫疾病的发病机制相关[11]。如Th17细胞和其分泌的IL-17能够破坏血脑屏障从而导致多发性硬化[12]。在类风湿性关节炎患者的滑膜液中能够发现IL-17的高表达[13]。在克罗恩病和溃疡性结肠炎患者中可以检测到Th17细胞的增加和高表达的IL-17[14-15]。

1.3Treg细胞1995年，Sakaguchi等[16]发现成年鼠的外周血中有近10%的 CD4+T细胞同时表达CD25，去除这群细胞会引起成年鼠产生多种自身免疫性疾病，而回输该细胞则能阻止疾病的发生，这群细胞被命名为调节性T细胞 (Regulatory cell, Treg)。此外，他们证实Treg细胞活性受到胸腺组织中许多细胞因子相互作用的影响，对维持自身耐受性至关重要[16]。至今，Treg在免疫疾病的发生发展中的关键作用已经被普遍认同和接受，Treg细胞能够抑制T细胞增殖和细胞因子的产生，并在预防自身免疫方面发挥重要作用。

在IL-10和TGF-β存在的条件下，反复刺激T细胞抗原受体T细胞 (T cell receptor ,TCR)，可以诱导Treg的产生。IL-2对Treg细胞的稳态、功能和发育至关重要。在缺乏IL-2的情况下，Treg细胞不能扩大其数量、不能存活或抑制T细胞增殖[17-19]。Treg细胞由胸腺中天然发育的Treg细胞 (natural Treg，nTreg) 和可诱导的Treg细胞 (induced Treg，iTreg) 组成。 虽然iTreg在表型和功能上类似于nTreg，但在表观遗传状态和稳定性方面存在差异[20]。

Treg可以通过4种机制来抑制效应性T淋巴细胞:①直接接触抑制，Treg细胞能够直接通过产生抑制性细胞因子 (IL-10、IL-35、TGF-β、galetin-1) 或通过产生直接细胞毒性作用因子和穿孔素释放与免疫细胞 (体外T淋巴细胞、记忆和自然杀伤细胞、B淋巴细胞、抗原提呈细胞) 的膜受体结合发挥作用[21]；②释放颗粒酶，通过产生称为颗粒酶的丝氨酸蛋白酶家族来抑制炎性细胞，缺乏颗粒酶的小鼠表现出Treg活性抑制；③产生抑制细胞因子 (IL-10, IL-35和TGF-β) 发挥其功能；④干扰靶细胞的代谢增加腺苷，主要通过IL-2、CD39和CD73途径[22]。

Treg细胞数量或功能失衡可能导致多种自身免疫性疾病发生，如多发性硬化、1型糖尿病、重症肌无力、系统性红斑狼疮、自身免疫性淋巴增生综合征、类风湿性关节炎和银屑病[23]。

1.4Th17与Treg细胞相互转化越来越多的证据表明CD4+T细胞具有一定的可塑性，特别是Th17和Treg细胞。Th17和Treg的细胞发育是由协调的细胞因子信号传导决定的。不同的细胞因子可能改变Treg/Th17谱系之间的微妙平衡，并改变T细胞分化，调节免疫系统的功能[2, 24-26]。TGF-β能够单独诱导TCR刺激的幼稚CD4+T细胞中Foxp3和RORγt的表达[24, 26]。因此，TGF-β是Th17和Treg细胞共同产生的的关键细胞因子，对诱导RORγt和Foxp3的产生是必需的。在没有明显炎症的情况下，TGF-β促进Treg分化，维持免疫耐受。这是由于Foxp3介导的对RORγt活性的抑制，导致IL-17和IL-23表达的消除[27]。尽管诱导了这些转录因子，但在不存在IL-6或IL-21的情况下，单独的TGF-β不能启动Th17细胞分化。根据周围的细胞因子环境，这些细胞可以转向促炎性Th17表型或诱导的调节性iTreg细胞表型。在IL-6或IL-21存在的条件，TGF-β诱导的Foxp3表达降低，RORγt表达上调，诱导Th17分化[24, 26, 28]。此外，通过控制Foxp3/RORγt平衡，IL-6和IL-21在Treg和Th17细胞之间存在的相互关系中起关键作用[24, 26, 29-30]。IL-6不仅在幼稚CD4+ T细胞中通过STAT3活化增强Th17-分化，而且还显示在TGF-β和IL-1存在下促进Tregs再分化成Th17细胞[30-32]。

总之，这些研究证实了Th17和Treg能够在一定条件下发生表型转化。为了抵抗某些微生物，拮抗其他细胞因子产生的信号，维持免疫稳态，细胞的表型和功能发生一定程度的转化来适应环境变化引起的生理功能改变。

1.5Th17/Treg平衡与自身免疫性疾病Th17和Treg细胞是构成免疫系统的复杂机制的一部分。健康的免疫系统不仅可以识别和抵抗感染，还可以调节针对组织自身抗原或无害的非自身生物的不良免疫反应。这需要在提供免疫应答的分子和细胞网络内建立精细平衡，如Th17和Treg细胞形成复杂和动态的网络以维持体内平衡。当耐受诱导的机制失败时，自身反应性免疫细胞存活，被激活并攻击自身的组织结构。这种不希望发生的免疫反应可以针对特定器官或多器官系统，并将导致称为自身免疫的现象。自身免疫性疾病通常以Th1或Th2优势为特征。然而，其他Th亚群如Th17和Treg细胞被认为与疾病严重程度和进展密切相关[33]。Th17细胞和Treg细胞之间的不平衡通常与某些自身免疫性疾病、传染性和过敏性疾病以及癌症相关[2, 34- 35]。

有越来越多的证据表明，Th17/Treg平衡的改变会导致疾病发生及其进展。已经显示，与健康对照相比，系统性狼疮患者具有显着减少的Treg水平和受损的Treg细胞抑制活性[36-38]。在风湿性关节炎的炎症条件下，Treg细胞失去其Foxp3表达并经历转分化为Th17细胞的过程[39]。这样的过程似乎依赖一种IL-6的机制。致病性Th17细胞在发炎的关节中累积并促成疾病的进展[39]。在多发性硬化的疾病模型中，有报道指出虽然复发与与Th17数量增加有关，但在缓解阶段可观察到Treg细胞水平升高[40]。并且两种Th群体的数量的波动似乎受miRNA簇的影响，表明miRNA作为多发性硬化治疗的靶标[41-42]。

2 miRNA对Th17/Treg平衡的调控作用

MiRNAs是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码RNA,其大小长约20～25个核苷酸。自1993年首次发现以来，miRNAs已被广泛认可为细胞分化、增殖、凋亡和发育的重要参与者[43-44]。此外，多项研究证明，miRNAs对免疫系统的正常功能包括免疫耐受和自身免疫也有着重要的调控作用[45,72]。miRNAs在很多自身免疫性疾病的发生发展中发挥着至关重要的作用。许多miRNAs参与Th17/Treg细胞平衡的调节。以下列举与Th17/Treg相关的miRNAs。

2.1miR-146a有报道显示miR-146a缺陷的小鼠可能会发展出更严重的实验性自身免疫性脑脊髓炎，这是人类多发性硬化症的动物模型。在识别自身抗原后，自身反应性CD4+T细胞启动TCR信号传导，导致NF-κB活化。NF-κB诱导产生激活STAT3的T细胞自分泌IL-6和IL-21细胞因子。 STAT3诱导表达Th17细胞分化的主转录因子基因RORγt，然后诱导Th17效应细胞因子如IL-17A和IL-21的表达。作为NF-κB信号传导的负反馈调节因子，miR-146a由NF-κB诱导，其反过来通过抑制NF-κB信号传导器TRAF6和IRAK1来下调NF-κB活性。通过下调NF-κB活性，miR-146a在自身反应性CD4+T细胞中阻断T细胞自分泌IL-6/IL-21 从而阻断Th17分化途径并抑制它们发展成致病性Th17细胞[46]。

有研究显示以类风湿性关节炎中增强的细胞因子产生为特征的Treg的促炎表型，炎症状况可能会导致Treg变得不稳定并改变表型，这种表型在自身免疫性疾病的演变过程中能够更有特异性的效应CD4+T细胞。Treg中miR-146a的改变表达可能与Tregs的这种表型相关[47-49]。有证据表明，响应miR-146a缺失的T细胞表型的变化，可能不仅仅是由于NF-κB信号传导，而且也因为miR-146a的其他靶基因，如STAT1，的增强表达而发生[50]。MiR-146a在Tregs中普遍表达，并且通过调节STAT1活性和对SOCS1介导的STAT1负调控作用发挥功能[50]。

2.2miR-155Yan等证明抑制 miRNA-155 能够调节自身免疫性心肌炎中的Th17/Treg平衡[51]。在自身免疫性肝病的疾病模型中发现抑制miR-155能够显著减轻了小鼠肝中Treg/Th17的比例，抑制了Th17细胞介导的促炎细胞因子IL-17A和IL-23的产生，但不能抑制Treg细胞介导的产生抗炎细胞因子IL-10[52]。

在重症急性胰腺炎的初始阶段，miR-155对SOCS1的抑制涉及JAK/STAT途径，导致Th17/Treg比率和炎性细胞因子表达水平的上调[53-55]。也有研究者认为，miR-155能够与SOCS1结合，然后抑制IL-6诱导的STAT3的活化，从而抑制IL-17A和Th17的产生[56-57]。而Foxp3依赖性调节是指当miR-155缺失会导致SOCS1过表达，从而抑制Smad5的磷酸化，通过负调节IL-2受体信号通路，抑制Treg增殖和分化功能[58]。也有研究证实Smad2是miR-155的靶分子之一，能够通过调节调控Smad通路参与Th17分化[56-57]。也有研究者认为miR-155可以和FOXP3直接结合，从而促进Foxp3的转录和翻译，从而发挥对Treg的调控能力[59- 60]。

总而言之，miR-155对Th17/Treg的调控作用主要是通过靶向调节SOCS1、STAT3和STAT5，从而调控STAT和Smad信号通路。

2.3miR-21有研究显示在胃癌切除术后的患者外周血中，IL-17水平降低且TGF-β1水平升高，Th17细胞的比例减少而Treg细胞的比例增加。通过体外试验发现，PD-1/PG-L1部分通过miR-21调节Th17/Treg平衡[61]。miR-21通过靶向和消耗SMAD-7 (TGF-β信号传导的负调节因子) 来促进Th17的分化。此外，miR-21缺陷的T细胞中，Th17分化减少与SMAD-2/3激活和IL-2抑制的缺陷相关[62]。在人的外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)中，miR-21表达增加通过TGF-β1/Smad信号通路引起Treg的下降，Foxp3表达减少和TGF-β1释放量降低[63]。有研究报道miR-21分别参与STAT3和STAT5的调控[64]。在患有类风湿性关节炎的患者的PBMCs中观察到miR-21和STAT3之间的负相关以及miR-21和STAT5之间呈现正相关性[65]。最近的研究发现外泌体中富含miRNA,包括miR-21,当外泌体被CD4+T细胞摄入后，能直接抑制STAT3,并调节Th17/Treg平衡[66]。类风湿性关节炎患者的miR-21水平显着降低，表明该反馈环失调可能导致Th17和Treg细胞比例的失衡[65]。

3 Th17/Treg失衡中的miRNA靶分子

3.1 TGF-β信号通路TGF-β信号传导在Th17和Treg细胞的产生中起重要作用。SMAD-7通过SMAD2/3的活化以及和SMAD-4形成复合物来阻止TGF-β诱导的转录反应。MiR-21和miR-181c通过直接靶向SMAD-7促进Th17细胞的产生[62, 67]。MiR-21过表达降低SMAD-7表达，同时增加SMAD2/3的水平，导致IL-17的产生。

TGF-β信号通过SMAD依赖性和SMAD非依赖性两种途径来调节Treg细胞分化和功能。尽管SMAD2/3依赖的TGF-β信号能够部分调节Treg分化，但在体内的SMAD2/3复合物的缺乏引起的疾病内会引起iTreg细胞活性的抑制。这可能与miR-21缺陷后引起的IL-2水平增加有关。由于IL-2能够稳定TGF-β诱导的Foxp3表达，在miR-21缺陷鼠中增强的IL-2表达能够补偿Treg分化过程中SMAD2/3依赖的TGF-β信号。

3.2IFN-γ信号通路IFN-γ介导STAT1磷酸化，诱导 T-bet, SMAD-7, 和 FasL的表达。T-bet 和 SMAD-7 能够负调节Th17细胞极化。此外， SMAD-7阻止了Treg细胞发挥其抑制免疫的功能。而STAT1作为miR-146a 的直接靶标，在miR-146a下调引起的Treg促炎表型的产生中发挥着重要作用[46]。

3.3Forkhead box O1 (FOXO1)FOXO1能够和RORγt相互作用，通过下调IL-1R和IL-23R来抑制Th17的促炎作用[68-69]。有研究发现miR-873能够靶向结合FOXO1从而促进系统性红斑狼疮患者中Th17的分化[70]。另一方面，FOXO1能够诱导Treg细胞中Foxp3的表达。在对实验性脑脊髓炎的研究中发现miR-182的下调可以增加外周淋巴结和脾脏中Foxp3的表达，在这个过程中FOXO1发挥着重要的调节作用，miR-182通过这样的途径能够抑制Treg分化[71]。

4 结 语

免疫系统是一个复杂的多网络多控点的调节网络。虽然Th17和Treg是两种作用相反的不同的T细胞亚群，但是他们具有相同的发育和作用机制。这两个细胞亚群的可塑性使Th17/Treg平衡在自身免疫和肿瘤等疾病的发生发展中发挥着重要的作用。目前，miRNA在免疫调节中的作用日益受到关注。研究miRNAs在Th17/Treg平衡中的作用，有助于深入了解免疫系统相关疾病的发生发展，从而为此类疾病的诊治提供新思路。