溶瘤病毒检测循环肿瘤细胞在膀胱癌精准治疗中的应用展望

李仕林综述，唐 勇审校

0 引 言

膀胱癌(bladder cancer, BC)是泌尿系最常见的恶性肿瘤之一，2018年全世界恶性肿瘤中膀胱癌排名第12位，新发病例数为549 393 万，死亡总数为 199 922万，泌尿系排名第二，男性中第六大癌症，发病率 9.6/10万,死亡率为 3.2/10万、仍持续升高[1]。 膀胱癌约75%早期诊断为非肌层浸润性膀胱癌(nonmuscle-invasive BC, NMIBC)，半数以上5年内复发，30%出现肌层浸润，预后差。膀胱癌诊断以及复发转移监测主要根据膀胱镜检，尿细胞学，以及影像学检查等，膀胱镜检成本高、有并发症风险，患者依从性差；尿细胞学检查敏感性低；计算机断层扫描(computer tomography, CT)和磁共振成像(magnetic resonance imaging, MRI)不能检测膀胱癌原位癌、微小病灶，早期病变发现困难；正电子发射计算机断层扫描(positron emission computed tomography, PET-CT)费用相对昂贵，用来评估原位癌也相对困难[2-5]，迫切需要新的非侵入性低成本的手段来改进BC的早期诊断，实时监测，来改进临床分期，检测微小残留病灶，预测治疗反应和预测预后，以及实现个体化治疗。因此，本文对膀胱癌的循环肿瘤细胞(circulating tumor cell，CTC)检测方法和溶瘤病毒检测CTC的临床价值以及未来在膀胱癌中的应用展望进行综述，以期为膀胱癌精准诊治提供一个新思路。

1 CTC检测方法

CTC是从癌症原发灶或转移灶脱落进入血液循环的恶性肿瘤细胞，可以提供较全面的癌细胞遗传信息，CTC评估可能比传统影像学方法更早发现疾病[6]，CTC检测可能用于早期癌症筛查、诊断、疗效评估和预测预后，从而实现个体化治疗[7-16]。尽管其临床应用前景广阔，但临床应用并没有取得预期的进展，目前CTC检测方法有逆转录聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction RT-PCR)、免疫亲和、物理检测、免疫物理结合以及高通量成像等技术,由于检测技术存在敏感性或特异性方面的不足，尚未标准化[9,17]，CTC在膀胱癌中相关临床价值尚未完全挖掘，从而推迟了膀胱癌精准医疗的演进。RT-PCR法是最常用的CTC检测方法，基于上皮特异性转录本和肿瘤特异性转录本在癌细胞高表达，在正常细胞不表达，通过将CTC数转化为探针数，检测快速、灵敏高效、成本低，不需分离CTC，然而以RT-PCR检测CTC的方法可能因特异性标志缺乏出现假阴性、非特异性扩增呈现假阳性，以及无法获得活的CTC用于下游培养和单细胞测序，其转录本在活CTC和死CTC都会表达，难以进一步区分[17-21]，免疫亲和技术的出现在一定程度上克服了RT-PCR的缺点,阳性富集法如Cellsearch是利用抗上皮细胞粘附分子(EpCAM)抗体包被的磁珠富集CTC，使用DAPI,CD45,CK等抗体鉴定CTC，是最常用的免疫学检测方法，其特异性相对较好[10,12-14,16]，另一些阳性富集法如AdnaTest和 CELLectionTMDynabeads是基于EpCAM抗体和MUC 1抗体、ERBB2抗体捕获分离CTC，使用多重RT-PCR检测CTC上肿瘤相关转录本。这些方法同时选择多种抗体捕获CTC, 可以增加CTC捕获数，增加其检测的灵敏度[17,19-20]。 但是，上述阳性富集法因部分CTC会经历上皮间质转化(Epithelial - to - mysenchymal transition,EMT)，产生干细胞或间充质表型，使得某些CTC的上皮标记物和肿瘤特异性标记不表达，也会导致CTC漏检产生假阴性，或因尿路感染等原因使得正常上皮细胞脱落可能导致假阳性的发生，而阴性富集法似乎能克服漏检的CTC，但因血液中白细胞数量繁多，使用CD45等抗体阴选CTC难以达到高纯度，而且不能将传统CTC与循环肿瘤微栓(circulating tumor microemboli, CTM)区分开来[22]。

CTC的大小形态和血细胞不同，因此可以通过CTC与血细胞间的大小差异来分离CTC，不依赖任何抗体和转录本表达，快速从全血中过滤分离CTC，可以获得更全面CTC亚群， Fina等[17]将基于形态学方法的screencell和将免疫富集技术和多重RT-PCR结合的Adnatest进行比较， screencell检测的阳性率超过80%，而Adnatest则在40%的转移患者中未检出CTC, 但是基于膜过滤的方法通量较低，容易导致血凝块堵塞，一些大的血细胞残留于膜上以及小的CTC丢失，还需抗体进一步鉴定[23]。微流控芯片也是基于细胞大小的CTC捕获分离，在一定程度上可以克服传统过滤的堵塞，低通量等问题。Lima等[24-25]使用基于大小的微流控芯片检测6例MIBC患者外周血CTC，平均CTC计数为59个/mL，CTC计数范围46～108/mL ,所有患者中，94%分离的CTC 上唾液酸聚糖抗原(sialyl-Tn ,STN)过表达，提示STN可能是一种新的CTC转移相关标记物， 并构建了一种基于STN亲和的微流体装置，用于STN+CTCs的分离。以上基于大小的无标记选择技术不仅具有捕获CTC类型更全面的优点，而且具有捕获的CTC可以进行细胞培养和分子分析的优点，但此种检测方法还存在一些不足,如比WBC小的CTCS容易漏检，大的WBC与CTC混杂，需要抗体进一步鉴定等缺点。一种新型基于细胞大小的平台-SMART BiopsyTM系统，该平台试图提高基于细胞大小的CTC检测技术的灵敏度和特异度，这个平台通过使用cocktail抗体孵育血细胞，进行密度梯度离心，收集含CTC的细胞悬液，然后使用基于大小的HDM芯片进行过滤富集CTC并转移到微管中，然后使用细胞计数器衡量细胞大小[26], Kim等[27]抽取膀胱癌患者外周血15mL,使用Smart BiopsyTM系统分离CTC，5 mL用于CTC计数，10 mL进行体外培养并使用Urovysion FISH法对培养的CTC进行分析，发现PT1增加到PT4阶段CTC总数量有增加趋势，同一阶段CTCs的免疫表型也表现广泛分布，在27例患者中，20例(74.1%)、14例(51.9%)和20例(74.1%)在第3、7、17号染色体扩增。9例(33.3%)第3和第7染色体扩增。16例(59.3%)第3和第17染色体扩增和9例(33.3%)出现7号和17号染色体扩增。单独扩增的患者中，17例(63.0%)符合Urovysion FISH阳性标准，9p21纯合性缺失。在不同的患者组中，来源于19例(70.4%)患者培养的CTC中有超过12个细胞符合Urovysion FISH阳性标准，这是首次将FISH Urovysion应用于膀胱癌CTCs的培养，可作为确定其来源和分析染色体异常的有效的第一步。将该平台主要考虑CTC的大小性质，但同时也考虑CTC免疫学特性和其它物理特性，可以在一定程度上有望提高CTC检测的灵敏度和特异度，但是需要大量抗体孵育，过程相对繁琐，对于技术人员要求较高，需要进一步研究验证。

无标记高通量成像技术克服了过滤和微流控无法捕获的比白细胞小的CTC的限制，克服免疫亲和方法的局限性，如Epic CTC平台和Accucyte-cyte Finder，Epic CTC平台是对血样进行红细胞裂解、离心后收集有核细胞，将有核细胞分散到玻片上进行自动免疫荧光染色，使用Epic的快速荧光扫描法和形态学算法分析每个有核细胞，区分CTC与白细胞，可以对感兴趣的CTC进行下游遗传分析，方便建立样本库，但需要到专业平台由专业人员处理，该平台也不能将存活的CTC和死亡CTC区分开来[28]。另一种高通量成像方法Accucyte-cyte Finder不需血样预处理，可以减少潜在CTC丢失，通过密度离心分离CTC和白细胞、将收集的有核细胞分散到玻片上进行自动多参数荧光染色，然后进行图像扫描分析，挑选感兴趣的CTC进行下游分析，这种基于密度富集有核细胞方法不考虑大小和细胞表面标记的表达，该平台不仅可以识别CTC而且可以发现CTC上新的靶标[29]， Chalfin 等[30]采用Accucyte-cyte Finder检测38例不同分期的膀胱癌患者CTC，在肌层浸润性膀胱癌(muscle-invasive bladder cancer，MIBC):7/12(58%), NMIBC：2/8(25%)，转移性膀胱癌：6/9(67%)。在NMIBC患者均未检出EpCAM(+)CTCs，MIBC 患者2例(17%)检出EpCAM(+)CTCs。转移性EpCAM(+)CTCs更多。结果表明BC在各期患者中均能检测到CTCs，检测到CTCs表现出细胞大小和EpCAM表达的表型多样性。在NMIBC患者和MIBC患者中均检测EPCAM阴性CTCs，但是高通量成像技术需要使用大量抗体对每个有核细胞进行染色鉴别，才能完成CTC的计数和鉴定，成本相对较高，另外该平台也难以区分血样中活着的CTC和死CTC，处理时间也相对长，以上各种检测技术不断成熟，但是不同CTC检测方法在检出率、回收率，纯度，成本、样本处理速度等方面有很大差异、对专业技术人员，细胞的生物学特性有较严格的要求，而溶瘤病毒法是利用携带荧光蛋白基因的溶瘤病毒能够特异性感染肿瘤细胞并在其内高表达荧光蛋白，然后通过荧光显微镜、流式细胞仪等成像系统进行检测，可以检测出更全面的CTC类型，包括上皮间质转换的CTC，干细胞样CTC，传统类型CTC，仅检测活的CTC，可以克服免疫亲和法检测死细胞的障碍，可以减少抗体孵育的步骤，使成本大大减少，另外操作简单，对技术人员、细胞大小形态、密度、表面标志物的表达未做要求，可以弥补现有其他CTC检测方法存在的上述缺陷， 溶瘤病毒法灵敏度、特异度高[30-37]，有望推进膀胱癌的早期筛查，诊断，疗效检测，改进临床分期，检测微小残留病灶，预测治疗反应和预测预后，以及基于患者分层的个体化治疗。

2 溶瘤病毒联合CTC的临床应用

2.1 溶瘤病毒联合CTC对肿瘤进行筛查诊断CTC作为标志物与疾病的诊断密切相关，Xiao等[31]收集63例肺癌患者外周血6 mL,红细胞裂解后，利用MOI=2的11型端粒酶腺病毒感染，固定染色后使用荧光显微镜及成像系统根据染色情况和形态学标准进行检测，结果此CTC检测系统的敏感性和特异性分别为89%(56/63)和90%(35/39)。肺腺癌、非小细胞癌和小细胞癌的CTC检测阳性率分别为84%(32/38)、92%(12/13)和100%(12/12), 初步证实腺病毒检测CTC是一种敏感、特异、简便无创的肺癌诊断方法，同样在肺癌中，Togo等[32]使用腺病毒OBP-1101结合荧光显微镜成像系统检测123例不同病理分期非小细胞肺癌患者血CTC,对Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期患者的检测的敏感性分别为59.6%、40.0%、85.7%和75.0%，结果表明溶瘤腺病毒OBP-1101是高度敏感的CTC检测系统，可作为NSCLC患者早期诊断的有效筛选工具。而Xu等[34]使用腺病毒探针检测黑色素瘤体外模型中CTC，在细胞系中检测的敏感性为88.7%，特异性为99.9%。上述使用不同的溶瘤病毒检测CTC的敏感度、特异度都很高，因此，使用溶瘤病毒检测CTC有望成为癌症患者的早期筛查诊断方法。

2.2溶瘤病毒联合CTC对肿瘤进行分期分级目前分期系统主要采用TNM分期，2010年将CTC纳入乳腺癌分期cM0i(+),新发布的一项研究证实CTC计数及分型与非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer，NSCLC)的TNM分期及转移相关[38]，为了探索CTC与肿瘤分期相关性，Zhang等[33]收集不同分期肺癌患者外周血4 mL，非小细胞肺腺癌52例(76.5%)，非小细胞肺鳞癌16例(84.2%)，小细胞肺癌9例(69.2%)，对40例肺腺癌分别用oHSV1-hTERT-GFP法和cellsearch法检测, oHSV1-hTERT-GFP法阳性率70%，cellsearch法阳性率25%，数据显示使用oHSV1-hTERT-GFP法检测CTC更敏感，且不同病理类型CTC数目不同，CTC数目M1>N+M0>N0M0,证实使用oHSV1-hTERT-GFP法检测CTC，可以实现对肺癌患者进行分期分级。因此，随着病毒法的引入，通过CTC计数进行癌症患者分期分级，并辅助TNM分期实现患者的风险分层，从而进一步实现肿瘤患者精准个体化治疗。

2.3溶瘤病毒联合CTC进行肿瘤疗效监测在肿瘤治疗前后进行CTC计数，基因组分析可以评估治疗效果以及药物的敏感性[39-40]。Ju等[41]使用端粒酶腺病毒检测2例肌层浸润性膀胱癌患者，患者1的CTC数目在放疗前0，放疗后数量202个CTC/mL,该患者最终死亡，患者2放疗前631个CTC/mL，放疗后194个CTC/mL，较放疗前明显减少，连续监测CTC可以评估治疗疗效，并获取辅助治疗的膀胱癌患者的管理信息，使用病毒法检测CTC进行疗效监测初步显示了可行性，但是要更好的评估治疗疗效，不能仅停留在CTC计数上，应进一步分析CTC的分子特征。Xu等[34]使用溶瘤病毒检测黑色素瘤患者中的CTC时发现BRAF突变状态与CTC显著增加有关，化疗后不再发现BRAF突变，BRAF突变状态与原发肿瘤吻合，证实了CTC的恶性来源，可以评估连续使用BRAF靶向药患者的疾病状况，判断疾病进展，并不断追踪患者的基因变化可以实现进一步精准治疗，所以，在治疗前后使用溶瘤病毒检测CTC数量变化，并在其基础上分析CTC相关基因变化，并与原发灶、转移灶基因位点比对，可以及时判断治疗疗效，调整治疗方案，从而实现精准治疗[42]。

2.4溶瘤病毒联合CTC对肿瘤进行预后评估可使用CTC作为标记物对肿瘤患者进行预后评估，判断无进展生存，肿瘤特异性存活，以及肿瘤的复发转移。Igawa等[43]使用腺病毒OBP-401法检测30例小细胞肺癌患者放化疗前后外周血活的CTCs，阳性率29/30(96%)。治疗前<2细胞/7.5mL组(基线)中位生存期明显长于治疗前≥2/7.5 mL组(分别为14.8个月和3.9个月，P=0.007)。多因素分析结果表明，基线CTC计数是影响生存时间的独立预后因素。在对治疗取得部分疗效的患者中，两周期化疗后CTC计数<2/7.5 mL的患者与有≥2/7.5 mL的患者相比，中位无进展生存期更长(分别为8.3个月和3.8个月；P=0.07)。因此，可以通过OBP-401法检测小细胞肺癌患者的CTCs，认为治疗前的CTC计数似乎是一个较强的预后因素。另外基于CTC突变位点的检测可以判断不良预后，在结直肠癌患者中，Shigeyasu等[35]使用溶瘤病毒OBP-401检测CTC时认为KRAS、BRAF基因突变在肝转移的频率显著高于原发肿瘤，KRAS 、BRAF基因突变状态的遗传分析可以预测KRAS野生型结直肠癌患者的转移潜能，其突变状态与不良预后显著相关。

2.5溶瘤病毒联合CTC对肿瘤进行个体化治疗手术切除，围手术期放化疗是目前癌症患者的主要治疗策略，但是仍有大量患者尤其是晚期患者无法从放化疗中获益，或者化疗耐药后没有进一步的治疗策略，在CTC计数的基础上，对癌症患者的分子分析可以实现精准靶向治疗和免疫治疗。Hwang 等[44]使用前列腺特异性腺病毒Ad5/35E1aPSESE4检测前列腺癌患者CTC时，对分离的CTC进行测序发现MMP9、Coffilin1、FCER1G、GPX1、SPP1、CD63、EMMPRIN、CD44等基因过表达，认为对基因组分析可以了解耐药机制，评估药物敏感性，进一步指导治疗决策， Shigeyasu等[35]使用流式细胞仪分选OBP401感染的表达GFP的上皮细胞，间充质细胞，上皮间质转换的CTC,通过直接测序或者突变特异性PCR的方法检测到结直肠癌患者外周血中CTC上的KRAS、BRAF、KIT突变，可以用于监测结直肠癌患者出现对EGFR抗体的西妥昔单抗的耐药性，根据已检测的基因突变进一步调整治疗方案用于下一步个体化治疗。基于此，对CTC的研究有助于提供新靶点，我们还可以发现新的免疫检查点指导靶向免疫治疗，Anantharaman等[28]发现PD-L1+不仅存在于CK-/CD 45-也存在 CK+/CD 45-的CTCs上，PD-L1+/CD 45-CTC负担高、凋亡CTCs负担低的患者总体生存率较低,这可能具有指导检查点抑制剂免疫疗法的潜力，这些免疫疗法已被确定为具有活性，在这部分患者中通常具有持久的反应[45]，因此，我们可以使用溶瘤病毒和流式细胞仪以及其他分选设备分选出病毒感染的表达荧光蛋白的细胞进行分子表征和单细胞测序发现新的治疗靶点和免疫检查点从而实现个体化治疗。

3 溶瘤病毒检测CTC在膀胱癌中的应用展望

目前膀胱癌CTC检测技术持续发展，尚未标准化，各种检测技术各有优缺点，但是一些检测技术间可以相互弥补一些缺陷，各种类型的重组溶瘤病毒相继被开发用于检测其他实体瘤患者CTC。评估CTC与临床价值的相关性的研究仍处于起步阶段，但是初步研究结果表明溶瘤病毒检测膀胱癌患者CTC表现出较高的敏感性，特异性，且具有不依赖抗体就可以检测传统类型CTC以及CTC亚群，不检测已经死亡的CTC,使检测CTC类型更有意义， 如前文所述，在2例BC患者中，Ju等[41]在放疗前后使用溶瘤腺病毒检测CTC，放疗后，1例CTC增多的患者最终死亡，另1例CTC明显减少的患者预后相对较好，结果表明可以用此方法在CTC计数层面进行膀胱癌患者的疗效追踪和预后评估。但是要发现疾病根源，对疾病深入研究不仅只停留于CTC计数，更要从单细胞测序层面进行分子分析，使用荧光溶瘤病毒结合流式细胞仪等光学成像设备分选CTC，进行单细胞测序，分析CTC亚群间、原发灶，转移灶间的基因组，转录组，表观遗传组间的差异，充分挖掘CTC的生物学信息有望推进膀胱癌患者精准诊治[42]，如在结直肠癌中的一项研究，Su等[8]使用阴性富集荧光原位杂交(SE-iFISH)在一名健康女性中检测出CTC, 并进行外显子测序判断癌症来源从而实现结直肠癌早期筛查早诊早治。在膀胱癌中，Yang等[46]在3个膀胱癌患者标本中对59个细胞进行单细胞测序，在膀胱癌干细胞中鉴定了21个关键的突变基因，其中6个新的突变基因ETS1，GPRC5A，MKL 1，PAWR，PITX 2和RGS9BP在BC中未见报道，并发现ARIDA 1、GPRC5A和Mll2在维持膀胱癌干细胞特性起着至关重要的作用，基于单细胞突变模式的肿瘤细胞分子分型有望提高BC诊治的准确率，新的突变基因的发现为膀胱癌的靶向治疗提供了更多的可能性。也可像使用溶瘤病毒检测胃癌患者腹腔冲洗液中的癌细胞一样利用溶瘤病毒检测膀胱癌患者腹腔冲洗液中的癌细胞来判断膀胱癌患者有无转移情况[47]。

因此，在膀胱癌的研究中，使用溶瘤病毒检测CTC,进行CTC计数和CTC单细胞测序, 充分挖掘CTC的生物学信息有望推进膀胱癌患者早期诊断、分期分级、疗效评估，预测预后，进而实现个体化治疗。将来可利用新型溶瘤病毒检测膀胱癌患者CTC[48-49]，并利用CTC体外模型、异种移植模型以及对膀胱癌临床样本进行验证。总之，使用溶瘤病毒检测CTC的技术在推进膀胱癌的精准医疗中有非常广阔临床应用前景。