基因组编辑技术在遗传性视网膜营养不良基因治疗和细胞治疗中的应用△

李润璞 金鑫

眼睛，尤其是视网膜，作为中枢神经系统(central nervous system,CNS)的延伸，与大脑共享解剖和发育特征，为神经元疾病的研究提供了一个强大而独特的“窗口”[1]。视网膜具有相对免疫赦免特性，并具有类似于大脑和脊髓中发现的特异性免疫反应。此外，视网膜易于分离，使其成为开发创新疗法的模型，将眼部疾病带到基因和干细胞疗法的临床转化应用前沿。本文回顾了基因组编辑技术在遗传性视网膜营养不良(inherited retinal dystrophies,IRDs)治疗策略的最新进展。

1 IRDs

IRDs是一组具有遗传和临床异质性的退行性疾病，可导致渐进性视力损害[2-3]。在全球范围内的发病率约为1/2000[4]。IRDs与250多个基因突变相关(http://www.sph.uth.tmc.edu/Retnet)，可导致光感受器细胞发育、功能和(或)存活异常以及视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)异常[5]，其遗传方式有常染色体显性遗传、常染色体隐性遗传或X连锁遗传。另外，复杂的多因素异质性疾病，如年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration，AMD)也被认为是一种视网膜变性疾病。

IRDs可分为非综合征型和综合征型，根据疾病进展和受累的视网膜区域，非综合征IRDs可进一步细分为各种亚型。首先，进展性病变的影响局限于中央视网膜(黄斑区)，可导致中央视力丧失，称为黄斑营养不良。最常见的是Stargardt病，其发病率为1/10 000，由ABCA4基因突变所致[6]。其次，进行性病变累及更广泛的视网膜区域，可根据最初发生退行性改变的光感受器细胞类型进行分类。杆锥细胞营养不良疾病首先影响视杆细胞，始发症状表现为夜盲，随后逐渐出现周边视力丧失。其中，最常见的是视网膜色素变性(retinitis pigmentosa,RP)，其发病率为1/4000，可由80多个基因突变致病[7]。当黄斑和外周视网膜都受到影响，并且从出生开始视网膜迅速退化，称为Leber先天性黑矇(Leber congenital amaurosis ，LCA)，发病率为1/50 000，分为18个亚型。此外，如果视网膜变化与脉络膜退行性病变有关，则被称为脉络膜视网膜病变。无脉络膜 (choroideremia,CHM)在本组疾病中最常见，发病率为1/50 000。综合征型IRDs除了眼以外，其他器官也会受影响，最常见者为Usher综合征，发病率为1/20 000，其特征是RP和听力损害[8]。

IRDs的单基因性质以及视网膜的可及性和免疫赦免特性，使其更适合采用未来最具发展前景的基因治疗，IRDs已经成为基因治疗的目标疾病[9]。最近，通过常染色体显性等位基因失活或隐性、X连锁等位基因校正等针对致病基因进行干预，作为一种可能的治疗策略已开始探索。由于IRDs具有不同遗传背景、不同发病率、发病年龄，临床过程多变，且受限于基因治疗的高度特异性，目前临床上还没有标准的治疗方案。

2 IRDs的基因治疗

基因扩增治疗为体细胞提供了突变基因的正常拷贝，适用于治疗单倍体功能不全或突变导致功能丧失的疾病。最常见但并非唯一的方法是正常基因由病毒载体携带对体细胞进行转染，从而进行稳定表达，例如腺相关病毒(adeno-associated viral ，AAV)载体[10]。AAV载体因其低免疫原性和毒性、无致病性，携带基因长期表达，遗传元件相对易于操纵，成为迄今为止最安全和最有效的将基因导入视网膜的病毒载体[11]。通过视网膜下注射给药，载体可进入光感受器细胞和RPE之间的视网膜下腔，对2种细胞进行转染，其特异性取决于所使用的血清型[12]。其他方法如玻璃体腔内给药，侵袭性较小、术后并发症较少，但视网膜转染的效率较低[13]。2001年RPE65基因突变LCA2犬模型的基因扩增治疗，是IRDs基因扩增治疗的一个重大里程碑。AAV2/2介导的RPE65治疗后，LCA2犬的视力长期恢复[14]。在此研究之后，视网膜下注射AAV-RPE65的效果由多阶段1/2临床基因治疗试验评估，证明一些患者的视力得到改善，且无载体不良反应。随后在LCA2患者中进行的3期临床试验，治疗载体双眼给药，与对照组相比，治疗组的视力显著提高，这成为第1例双眼均成功治疗的眼科临床试验[15]，其载体药物voretigene neparvovec(Luxturna)已经商业化。在AAV-RPE65试验之后，X连锁无脉症的基因治疗研究也已开展。使用同样的方法，在Chmnull/WT小鼠中完成了临床前研究[16-17]，其他AAV血清型如AAV2/5和AAV2/8对无脉症也有效[18]。最近，使用AAV2/2载体进行治疗MERTK基因导致RP的一期临床试验已开始[19]，其他AAV血清型载体治疗基因突变导致的IRDs的各种临床试验也已在世界范围内陆续开展，但结果尚未见报道。

尽管AAV载体有许多优点，但为了克服其克隆能力有限(<4.7 kb)[20]这一局限性，研究人员使用慢病毒马传染性贫血病毒(equine infectious anemia virus，EIAV)作为载体。EIAV可以整合到人类基因组中，但对人类无致病性。首先使用EIAV作为载体的是具有6.8 kb编码序列的ABCA4基因。临床前期研究显示，Abca4-/-小鼠模型中，与对照组相比，治疗组小鼠RPE中毒性A2E蓄积减少[21]。

尽管在LCA2试验中，接受治疗的患者视力改善有所不同，但长期随访研究显示视网膜仍在继续退化[22]，这可能是由于治疗处于疾病晚期过程，此时变性过程不再停止[23]。视网膜变性的进展阶段与基因扩增治疗不相容，基因扩增治疗成功的前提是非功能性靶细胞仍然存活。进展期的IRDs患者可能从细胞移植疗法中得到更好的效果，该疗法具有恢复视觉功能的潜力。

3 基因组编辑技术在IRDs治疗中的应用

基因组编辑最初是通过使用工程化大分子核酸酶和锌指核酸酶(zinc finger nucleases,ZFN)来触发特异性靶向基因组序列。随后，转录激活子样效应核酸酶(transcription activator-like effector nucleases,TALEN)的研究，以及最近簇集式规则间隔的短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)和crisp相关基因(Cas)系统的出现，导致了一场基因组编辑的科学革命。

3.1 ZFNs和TALENs无论使用哪种工具，有效的基因组编辑都着眼于在基因组中精确位点引入双链断裂(double strand breaks，DSB)，这也是迅速刺激细胞2条DNA修复的途径之一[24]。为了诱导DSB、ZFNs和TALENs，需要通过蛋白质-DNA结合域引导到靶序列。因此，他们不得不为每个靶标设计新的蛋白质，这使得基因组编辑变得困难、费力且具有挑战性[25]。ZFNs由可修饰的锌指结构域和由FokI核酸酶[26]组成的切割结构域构成，锌指结构域被设计成结合靶向基因组中的特定序列。ZFNs应用的主要局限性在于锌指的设计，需要结合基因组中每3个碱基对的组合，这尚未实现。因此，许多位点不能作为这些工程化核酸酶来靶点。尽管面临挑战，ZFNs已作为治疗概念应用于视网膜疾病中。表达RHO基因 Pro23His突变的人胚胎视网膜祖细胞已经成为ZFNs治疗靶点，使用同源供体模板转染ZFN，比单独转染ZFN时的同源重组效率增加[27]。类似地，研究人员在稳定表达导致Usher综合征1C型错义突变Ush1c的HEK293细胞中实现了位点特异性基因校正[28]。这些研究首次证明了ZFNs用于治疗视网膜营养不良基因打靶的可行性。

TALEN是ZFN的替代品，它通过融合TAL效应器DNA结合结构域与Fok I核酸酶切割结构域进行设计，代表了从设计到实现更快、更经济的转变。然而，TALENs更适用于较大的蛋白质，并且含有导致TALEN失活的重复DNA序列[29]。此外类似于ZFNs，TALENs需要为每个DNA靶标设计新的蛋白质，这对于基因组编辑研究人员来说仍然具有非常大的挑战性。TALENs技术也已应用于视网膜疾病，用来纠正LCA8模型Crb1rd8小鼠中的突变。用针对Crb1rd8等位基因的mRNA编码TALENs与单链寡核苷酸(ssODN)联合处理小鼠卵母细胞，以纠正致病等位基因。经治疗，TALEN联合ssODN修复了27%小鼠胚胎，提示眼部症状可以得到改善[30]。

3.2 CRISPR/CAS系统与ZFNs和TALENs相比，CRISPR/CAS系统代表了一种新颖而有效的基因组编辑方法。1987年，研究人员发现细菌基因组中IAP基因存在“不寻常的”3个区域，含有29个碱基重复序列，之间间隔32个非重复性核苷酸[31]。后来，在许多细菌和古细菌中发现了类似的重复序列[32]。2000年，这些在细菌基因组中观察到的重复序列使用首字母缩写CRISPR来进行统一。研究人员在编码基因相邻的位置发现的几个重复序列群，称为CRISPR相关基因或Cas基因[33]。2012年，CRISPR作为基因组编辑系统首次被提出。Jinek等[34]发现，两RNA分子存在时，链霉菌链球菌CRISPR/Cas系统(spCas9)能够诱导DSB，CRISPR RNA(crRNA)和反式激活RNA(tracrRNA)结合形成tracrRNA/crRNA复合物单一指导RNA(gRNA)，它可以同样有效地结合到靶DNA。这个融合基因组5’端的20个核苷酸可设计成特定目标序列，使特定基因组可以使用CRISPR技术进行编辑。gRNA和PAM序列的结合，引导核酸内切酶Cas9进行DNA靶向特异性切割[35]。CRISPR/Cas系统为大量生物和细胞提供了有效的基因修复[36]。

研究人员将gRNA的识别位点结合到spCas9质粒中，限制了Cas9的表达时间，开发了一个CRISPR/Cas9自限系统，这种自我限制的Cas9方法降低了不希望发生的非靶点作用、潜在毒性和SpCas9特异性细胞免疫应答的机会[37]。此外，具有不同PAM基序的Cas9核酸酶的使用和发展可扩大CRISPR/Cas技术在整个人类基因组中的应用[38]。

3.3 CRISPR/Cas体内基因组编辑基因组编辑存在2种不同的方法：一种是体内方法，致病突变在视网膜中直接纠正；另一种是体外方法，在患者的细胞中纠正突变后进行细胞移植。CRISPR/Cas在动物模型中的基因组编辑研究对于研究和开发可能的治疗技术至关重要，有望成为挽救患者残余视力的方法之一[39]。研究人员面临的最大挑战是将CRISPR系统直接输送到视网膜特定的组织或细胞中，如上所述，AAV载体是针对多种视网膜细胞包括光感受器细胞和RPE细胞在内的最有效的基因传递方法[40]，但其有限的克隆能力限制了其作为CRISPR/Cas载体的应用。Hung等[41]在小鼠视网膜上通过玻璃体内注射AAV2/2载体介导CRISPR/Cas系统的传递，CRISPR/Cas系统设计成可以破坏Thy1-YFP转基因小鼠模型中黄色荧光蛋白的表达，导致YFP表达降低84%，为CRISPR/Cas基因组编辑在活体视网膜中的应用提供了证据。小鼠视网膜下注射AAV2/5 CRISPR/Cas9双重系统敲除了野生型小鼠LCA10基因CEP290的内含子25，该内含子与包含LCA10最常见的致病突变的人类内含子26同源[41]，为通过敲除内含子变异进行治疗的概念提供了证据。研究还集中于增加CRISPR/Cas系统目标宿主序列库，这取决于Cas9对PAM序列的识别。其中，识别NNGRRN PAM基序的金黄色链球菌Cas9具有双重优势，因为其较小(3.1_kb与SpCas9的4.2_kb)，适用于AAV病毒体内转染[42]。

纯化的Cas9核糖核蛋白(ribonucleoprotein，RNP)作为AAV的替代递送途径也已在视网膜中进行了研究。Cas9 RNP复合物在递送后24h内降解，减少了Cas9暴露的时间，潜在地减少了非靶点作用[43]。Cas9 RNP靶向VEGF在CNV小鼠模型中的视网膜下递送显著降低了VEGF表达，提供了该方法可用于AMD患者的体内治疗的初步证据，为AMD患者反复注射抗VEGF药物的替代治疗提供了可能性[44]。更重要的是，扩大了使用直接投递纯化Cas9蛋白治疗视网膜营养不良的可能性。Cas9 RNP在视网膜细胞中投递是否与病毒载体介导的视网膜下注射递送一样有效，尚需进一步研究。

上述体内研究主要是应用CRISPR/Cas9技术介导非同源末端连接(non-homologous end joining,NHEJ)，导致缺失(insertion-deletion ，INDEL)和基因失活。由于光感受器细胞是有丝分裂后的细胞，在很大程度上缺乏同源定向修复(HDR)机制，因此如何在视网膜中实现有效和准确的基因组编辑仍然是一个有待解决的主要问题。Suzuki等[45]研发了一种新的策略——同源独立靶向整合(HITI)，使非分裂细胞如光感受器细胞，靶向敲入NHEJ。在RP大鼠模型中视网膜下注射AAV2/8或2/9介导的HITI系统后，正确敲入后维持了视网膜外核层的厚度并改善了视觉功能。因此，这种方法依赖于NHEJ机制而非HDR，来整合所需的DNA序列，可针对有丝分裂后的神经元，是非常有前景的解决方案。

CRISPR/Cas9系统和HDR在临床前动物模型中也进行了应用。Wu等[46]利用这种技术来确定rd1小鼠模型中导致的RP表型的致病变异。rd1小鼠携带Pde6b基因两个纯合变异：第7外显子中的无义突变(Y347X)和第1内含子中的小鼠白血病病毒插入。在CRISPR介导的对无义变异体的纠正之后，治疗小鼠的视网膜表型被恢复，表明Y347X突变具有致病性。类似地，通过使用CRISPR/Cas9技术生成Reep6的小鼠敲入模型，证实了REEP6中一个新的错义突变是导致RP的致病突变[47]。

CRISPR技术之前最大的挑战之一是常染色体显性遗传疾病的治疗，因其突变等位基因的特定失活后需要恢复表型。CRISPR技术的发展已经改变了显性疾病的治疗前景，其中一种很有希望的治疗方法是通过一种被称为CRISPR干扰(CRISPRi)的策略来减少基因转录[48]。在这个策略中，Cas9缺乏核酸酶活性，称为失活Cas9(dCas9)。当dCas9与gRNA特异序列结合时，转录机制发生阻断，阻止RNA聚合酶和转录因子转录基因，是对RNA干扰策略的改进。目前，这一策略已成功地在真核细胞和人类细胞中实现[49]，但尚未应用于视网膜变性疾病，因其最小的非靶效应，该策略具有巨大的潜力。利用CRISPR/Cas9技术敲除突变等位基因是另一种策略，且已在编码视紫红质(rhodopsin ,RHO)的基因突变导致的显性遗传RP中得到应用。Bakondi等[50]针对RHO S334突变RP小鼠模型中的一个等位基因特异性PAM序列，在视网膜下注射并电穿孔CRISPR后，挽救光感受器细胞表型，提高了53%的视力，为使用CRISPR/Cas系统来灭活人类常染色体显性致病性等位基因提供了巨大的希望。

目前尚无CRISPR用于眼科疾病的临床试验。将来，EDITAS医学将致力于将上述CEP290跳过内含子26的方法引入LCA10患者治疗中。

4 外基因校正与细胞治疗在IRDs治疗中的应用

除了通过靶向功能失调的细胞来停止或至少减缓疾病的进展以外，另一个有前途的治疗视网膜变性的方法是干细胞衍生的视网膜细胞移植。视网膜由神经外胚层发育而来，像其他任何中枢神经系统组织一样呈现低再生潜力。因此，由光感受器细胞退化或丢失引起的IRDs可因细胞治疗受益，恢复功能性视网膜并逆转眼部病变。

首次证明功能性光感受器替换的证据，是在将新分离的杆状光感受器移植到视网膜下腔获得的[51]，然而，由于其有丝分裂状态，不能在体外增加移植细胞的数量。因此，如何在体外扩增光感受器细胞，是有效地移植到供体视网膜的关键。Lamba等[52]研究表明，人类胚胎干细胞(embryonal stem cells,ESCs)可以定向于视网膜细胞分化，成为视网膜前体。将这些ESCs衍生的光感受器前体细胞移植到LCA小鼠模型的视网膜下腔，可以使小鼠的对光反应恢复[53]。ESCs因其高增殖、自我更新和分化潜能，成为体外研究人类疾病的理想工具，但ESCs的伦理困境严重阻碍了其全部潜力的开发。Takahashi等[54]通过重编程将成人成纤维细胞诱导成为多能干细胞(induced multipotential stem cells,iPSCs)，该过程涉及4个转录因子的表达，这些转录因子使体细胞恢复到多能状态。这些细胞具有替换患者组织的潜力，并且可以作为人类疾病研究的大量细胞来源[55]。此外，iPSCs来源的细胞在细胞移植方面有2个主要优点：避免了与使用胚胎或胎儿组织有关的伦理问题，并且提供了自体移植，从而避免了免疫排斥风险的可能性。

胚胎干细胞和间充质干细胞广泛应用于干细胞来源的感光细胞移植，研究者使用小鼠和人ESCs模拟3D培养中的光学形态发生，从而获得大量适于移植阶段的光感受器前体细胞，使该领域发生了革命性的变化[56]。继续开发更优化和标准化的分化方案，将会使得人类ESCs和iPSCs对人类眼病的研究和治疗产生巨大影响。为了纠正功能变异的外显子、内含子和功能域变异：MAK外显子9中靶向插入Alu恢复了视网膜转录本和蛋白质；NHEJ纠正了CEP290导致的LCA10的隐性剪接变异；特异性靶向突变等位基因使RHO基因中的显性Pro23His突变无效[57]；使用CRISPR/Cas9和HDR纠正了导致Usher综合征2型的USH2A基因中最普遍的c.2299delG突变[58]。这些研究对个性化iPSCs治疗视网膜疾病疗法的可行性表达了支持。另一方面，在iPSCs中，CRISPR/Cas技术已经用于荧光报告基因敲入Crx基因(光受体特异性转录因子基因)的末端密码子，实时监测光感受器分化[59]，展示了该技术在基础研究领域的前景。

干细胞衍生的感光细胞移植可以恢复视杆和视锥细胞功能，近期研究表明，有丝分裂后供体和宿主光感受器细胞参与细胞物质的转移，如RNA和蛋白质，包括视紫红质[60]，但这些移植细胞未整合到宿主未退化的视网膜。最近研究表明，细胞整合和细胞质转移可以发生在宿主退化过程中，其对疾病的影响取决于宿主环境[61]，阐明这种细胞物质转移的潜在机制可导致一个新的治疗途径，即将功能性蛋白引入功能失调的感光细胞作为基因替换的替代品。它表明了递送纯化的蛋白质Cas9，作用于活体光感受器细胞的基因组编辑的可能性。干细胞衍生的光感受器细胞的使用是理解人类视网膜发育和疾病建模的有力工具，开发细胞移植疗法具有巨大潜力，hESC和hiPSC衍生的RPE细胞移植已经开始进行临床试验。最初，hESC衍生的RPE作为游离细胞注射到AMD和Stargardt患者视网膜下腔中，这些细胞在宿主视网膜中随着时间的推移持续安全存在，一定程度上挽救了患者视力[62]。最近，一个合成RPE基底膜，包括完全分化的hESC衍生的RPE单细胞涂层，被移植到AMD患者视网膜下，1 a随访显示膜片稳定持久，与视力提高和阅读速度提高有关[63]。这些疗效是否会随着时间的推移而保护稳定尚不确定。最近使用自体hiPSC衍生的RPE单层进行视网膜自体移植，1 a随访表明，移植是安全的，即使在没有免疫抑制的情况下，也没有引起免疫应答[64]，这为将来基因组编辑视网膜细胞自体移植提供了希望。基因校正对于基因突变修复后细胞的移植非常重要，需要严格的质量控制。此外，在移植到患病的宿主视网膜之前，必须对由CRISPR/Cas可能触发的非靶效应进行详细筛选。

5 未来的挑战与展望

眼，特别是视网膜，已被证明是开发先驱疗法的有力模型，该疗法将应用于中枢神经系统的其他部分[65]。尽管目前研究成功地使用CRISPR/Cas系统对基因组进行了相对容易和精确的操作，但技术仍在进一步改进中。这些技术的改进重点在于开发更有效的传递方法，识别和理解非靶标事件，以及提高突变校正的效率，所有这些问题都应在该策略能够安全地应用于临床之前得到解决。此外，与基因治疗和细胞治疗相关的伦理问题也越来越突出，如何在技术进步的同时保持伦理的进一步发展，避免在临床应用领域遭遇伦理困境，值得研究者警惕和关注。