糖尿病肾脏病中足细胞自噬调控机制的研究进展

韩妙茹，杨康，杨洪涛

(天津中医药大学第一附属医院肾病科，天津 300380)

糖尿病肾脏病(diabetic kidney disease，DKD)是肾病终末期的主要病因[1]。临床中，DKD患者最初表现为微量蛋白尿，随后发展为大量蛋白尿，肾小球滤过率降低相对较晚，最终进展为终末期肾病。研究发现，约10%的1型或2型糖尿病患者在患糖尿病25年后出现蛋白尿[2]。因此，蛋白尿是一项可以预测肾脏损害的重要指标，其主要是由肾小球滤过膜结构和功能改变引起，而足细胞是肾小球滤过屏障结构和功能正常的重要组成部分，故足细胞损伤是引起大量蛋白尿的原因之一。自噬是一种高度保守的细胞循环过程，其能将蛋白质以及受损的细胞器进行自我降解和重建，对维持细胞内稳态至关重要。研究表明，足细胞是一种高度分化的细胞，有丝分裂后的足细胞具有很高的基础自噬水平[3]，高糖状态诱导足细胞自噬功能失调，导致足细胞严重受损，进而导致大量蛋白尿。迄今为止，已发现了40多个自噬相关基因(autophagy associated gene，ATG)及通路[4]。研究证实，营养感应信号途径及胞内应激反应信号所介导的自噬与DKD发病密切相关[5]。现就DKD中足细胞自噬调控机制的研究进展予以综述，并着重介绍足细胞自噬在DKD中通过营养感知信号途径和细胞内应激信号的调节作用。

1 营养传感途径

营养传感途径主要包括丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶[哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)]、AMP活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)及氧化的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD)依赖性组蛋白脱乙酰酶[沉默信息调节因子1(silent information regulator 1，SIRT1)]三种。当营养过剩时,葡萄糖、氨基酸等营养物质的增加会激活mTOR，从而抑制自噬；当营养和能量缺乏时，AMPK和氧化的NAD依赖性组蛋白脱乙酰酶(SIRT1)被激活，从而促进自噬[5]。因此，mTOR对自噬起负调控作用，AMPK和SIRT1对自噬起正调控作用。

1.1mTOR信号通路 mTOR是DKD中最关键的自噬调节因子之一，也是感受细胞外营养、调控蛋白质的合成速率、影响细胞生长的核心。研究发现，mTORC1和mTORC2对雷帕霉素存在敏感性差异[6]。当营养过剩时，mTORC1被激活，并磷酸化ATG13，自噬受到抑制；而在营养和能量缺乏、应激状态下，mTORC1活性受到抑制，ATG13磷酸化水平降低[7]。去磷酸化的ATG13与ATG1(unc-51样激酶1)和ATG17(骨架蛋白FIP200)形成复合物，从而启动自噬[8]。雷帕霉素是一种用于预防器官移植排斥反应的免疫抑制剂，是mTOR信号通路的特异性负调控因子。它可以抑制mTORC1活性，从而诱导自噬，维持细胞稳态[5]。以往研究表明，雷帕霉素可以改善肾小球肥大，系膜扩张、肾小球基膜粘连、肾纤维化，以及DKD患者蛋白尿的发展[9]。在胰岛素抵抗条件下，足细胞自噬活性下降，当给予mTOR特异性抑制剂——雷帕霉素治疗后，自噬激活，从而减轻胰岛素抵抗诱导的足细胞损伤[10]。Inoki等[11]研究发现，在杂合子mTOR的调节相关蛋白敲除小鼠的足细胞中，mTORC1活性被部分抑制，提示mTORC1信号过度激活与足细胞损伤进展密切相关，同时也与糖尿病模型小鼠的蛋白尿相关。可见，mTOR信号通路负性调控足细胞自噬对于DKD的发病机制起重要作用。其中，mTORC1的活性在维持足细胞稳态中至关重要。

1.2AMPK信号通路 AMPK是一种应激激活激酶，是一个重要的细胞能量感应器，主要通过感应AMP与ATP的比例调节细胞的能量状态。当细胞能量不足时，一方面，AMPK通过结节性硬化复合物1/2-Rheb信号通路或调控其他相关蛋白(如mTOR的调节相关蛋白)磷酸化与mTORC1相互作用，从而抑制mTORC1的活性；另一方面，AMPK可以与丝氨酸317、丝氨酸555和丝氨酸777位点结合并直接激活unc-51样激酶1，诱导自噬[12]。近年来研究表明，小檗碱具有良好的调节血压，控制血糖和抗癌，抗炎等功效[13]。小檗碱是一种有效的自噬激活剂，Choi等[14]研究发现，小檗碱可以减轻高糖诱导的mTOR激活，增强AMPK活化，诱导自噬，从而减轻高糖诱导的足细胞损伤。在糖尿病小鼠的足细胞中，磷酸化的AMPK水平较低，而二甲双胍可以增强AMPK磷酸化，降低mTOR活性，从而改善高糖诱导的足细胞损伤[15]。

1.3SIRT1信号通路 SIRT1是一种高度保守的NAD+依赖的Ⅲ类组蛋白去乙酰化酶，作为一种细胞内营养感应器，其通过检测NAD+水平调节细胞代谢及氧化还原状态。研究表明，SIRT1在DKD的进展中发挥了重要作用[16]，当细胞内能量缺乏时，AMPK被激活，NAD+水平升高，激活SIRT1活性。一旦被激活，SIRT1脱乙酰化ATG，如ATG5、ATG7等；同时，SIRT1还可以将叉头转录因子脱乙酰化，从而调控自噬下游相关通路[17]。Chuang等[16]观察发现，在高糖刺激下，具有广泛SIRT1基因敲除的糖尿病小鼠表现出DKD的早期特征，且足细胞特异性SIRT1基因缺失可加重糖尿病db/db小鼠的蛋白尿。因此，在足细胞的稳态维持中SIRT1发挥了重要作用。Hong等[18]研究发现，SIRT1过表达可有效缓解糖尿病ove26小鼠(胰岛β细胞上钙调蛋白基因超表达，从而导致胰岛素缺乏并产生1型糖尿病的一种小鼠)的蛋白尿及肾损伤。研究证明，SIRT1可将转录因子p65去乙酰化发挥生物学作用，在db/db小鼠中，足细胞特异性的SIRT1基因敲除导致p65乙酰化水平升高，从而抑制核因子κB信号通路，SIRT1是核因子κB的一种关键抑制剂，其在糖尿病肾脏炎症调节中发挥关键作用[19]。

2 细胞内应激

2.1氧化应激 研究表明，活性氧类(reactive oxygen species，ROS)是激活自噬的最常见因子[20]。在高糖状态下，细胞呼吸功能失调会产生大量的超氧化物(超氧阴离子自由基)，以及其他ROS，为了继续维持细胞稳态，哺乳动物会产生抗氧化酶和非酶物质，包括过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽和硫氧还蛋白等[21]。它们可以对抗ROS引起的细胞损伤。当生成的ROS与抗氧化酶调节失衡时，细胞出现氧化损伤。研究表明，ROS的增加可激活蛋白激酶R样内质网激酶，随后磷酸化真核细胞起始因子2α，激活ATG4，加速可溶性微管相关蛋白1轻链3-Ⅰ型的形成，并抑制mTORC1活性，从而诱导自噬[20]。虽然足细胞自噬与氧化应激的作用尚未被完全阐明，但有证据表明高糖诱导了足细胞自噬，同时高糖能促进足细胞产生ROS，而抗氧化剂可以抑制高糖诱导的自噬[22]。因此，ROS在高糖诱导的足细胞自噬中具有重要作用。Zhan等[23]研究发现高糖条件下，足细胞发生氧化应激和炎症反应，而雷公藤红素可通过恢复血红素加氧酶-1介导的自噬途径，保护高糖状态下的足细胞损伤。肾素-血管紧张素-醛固酮系统活性升高是慢性肾脏病进展的一个重要原因。足细胞是醛固酮的靶标之一，Bai等[24]发现，ROS诱导的足细胞自噬可以显著抵消醛固酮诱导的足细胞损伤，抑制ROS的产生，对醛固酮诱导的足细胞损伤具有保护作用，因此ROS在足细胞自噬形成中起关键作用。

2.2内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS) 近年的研究表明，ERS可以参与多种肾脏疾病，可诱导足细胞结构和功能障碍，进而导致肾小球硬化[25]。内质网主要参与蛋白质的合成、修饰与加工。因此，ERS指在某些情况下，出现错误蛋白或未折叠蛋白堆积的生理或病理状态，这被称作未折叠蛋白反应(unfolded protein response，UPR)。UPR主要由蛋白激酶R样内质网激酶、活化转录因子6、肌醇依赖酶1三个分支组成。在特定环境下，三个分支均可以调节细胞自噬[5]。其中，肌醇依赖酶1α通过与凋亡信号调节蛋白1/c-Jun氨基端激酶信号通路相互作用，磷酸化Bcl-2，导致Bcl-2与Beclin-1(酵母ATG6的同系物)解离，激活Beclin-1和磷脂酰肌醇-3-羟激酶复合物，从而诱导自噬。蛋白激酶R样内质网激酶、活化转录因子6可以上调ATG3、ATG12、ATG5等自噬基因的表达，从而促进自噬。在足细胞中，糖尿病环境下的代谢变化会扰乱UPR、自噬以及mTOR信号通路的平衡状态[26]。此外，非酯化脂肪酸、高血糖[27]、胰岛素信号缺陷[28]均可诱导ERS。而研究证明，UPR的调节剂牛磺熊脱氧胆酸可以治疗链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠，减轻高糖诱导的足细胞损伤和蛋白尿，改善组织病理学损害[3]。UPR的激活既触发了C/EBP同源蛋白依赖的细胞凋亡，又触发了自噬来应对损伤。Wang等[29]在轻度2型糖尿病和高血压联合的动物模型中，使用ERS抑制剂(牛磺熊脱氧胆酸)降低了血压，改善了肾功能，提示高血糖与高血压共同增加ERS，扩大肾损伤，而抑制ERS可以明显减轻糖尿病高血压肾病的肾损伤。因此，糖尿病和高血压可以通过ERS协同作用促进肾损伤。在糖尿病db/db小鼠中，应用牛磺熊脱氧胆酸治疗后，持续的高糖导致的足细胞自噬缺陷被明显纠正[30]。上述研究表明，ERS和足细胞自噬在DKD的发生发展中起重要作用。

2.3低氧应激 缺氧是DKD进展的一个重要事件，研究表明，缺氧是公认的一种肾脏发病途径[31]。缺氧诱导因子(hypoxia-inducible factor，HIF)家族在器官组织缺氧的调节中发挥重要作用，其家族成员主要有HIF-1、HIF-2、HIF-3三种转录因子，其中HIF-1是细胞适应氧浓度变化的主要调控因子[32]，包括HIF-1α和HIF-1β。以往的研究显示，HIF-1α在缺氧条件下的足细胞中显著增加[33]。在缺氧条件下，HIF-1α被激活，上调腺病毒E1B 19 kD相互作用蛋白3的表达，当腺病毒E1B 19 kD相互作用蛋白3表达水平升高时，Beclin-1从Bcl-2/的抑制作用中解离出来，与多种蛋白质相互作用形成Ⅲ类磷脂酰肌醇-3-羟激酶复合物，引导自噬体的形成[34]。Bohuslavova等[35]在链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠模型中发现，在DKD早期，HIF-1α缺乏会影响足细胞存活，导致糖尿病肾小球损伤，提示HIF-1信号受损会加速足细胞丢失及其维持肾小球滤过屏障的能力，从而加速DKD进展。因此，HIF-1在预防糖尿病引起的组织损伤的早期反应中起重要作用。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是HIF-1α最有代表性的下游调控因子，其主要由足细胞合成，是血管生成的促成剂[20]。研究表明，VEGF过表达可增加肾小球的血流量和通透性，导致足细胞损伤，其结果可能最终导致肾小球硬化，因此血清VEGF水平可作为慢性肾脏疾病进展的预测因素之一[36]。Miaomiao等[37]在链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠足细胞中发现，高糖可引起足细胞足突消失和VEGF上调。用自噬诱导剂雷帕霉素治疗后，VEGF的活化被显著消除，足细胞损伤得到改善；而用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤处理的足细胞的VEGF表达增加，表明自噬在调节VEGF中起重要作用。以上研究证明，足细胞自噬与HIF-1α/VEGF有一定的联系，需进一步探索。

3 其他相关信号通路

目前，DKD中足细胞自噬相关信号通路仍在研究中。除上述营养传感途径与细胞内应激信号外，以往的研究表明，ATG12-ATG5共轭体系在足细胞自噬中也起了关键作用，它通过促进自噬小体的产生，激活足细胞自噬[38]。β-抑制蛋白(β-arrestins，ARRBs)是一种多功能蛋白，研究表明，沉默ARRB1或ARRB2基因可以恢复高糖状态下降低的ATG12-ATG5水平，促进自噬。而ARRB1/2和ATG7之间的相互作用增强，可能会阻止ATG7激活ATG12的甘氨酸残基，从而减少ATG12-ATG5的结合并抑制自噬，加重DKD状态下的足细胞损伤[38]。Ji等[39]研究表明，缝隙连接蛋白43的表达增加可以激活DKD中的mTOR信号通路，抑制足细胞自噬，而抑制缝隙连接蛋白43表达，可以激活足细胞自噬，减少足细胞损伤。长链非编码RNA在DKD的发病中也扮演重要角色，学者发现在链脲佐菌素诱导的DKD小鼠中，长链非编码RNA肺腺癌转移相关转录本1的功能失调，并参与高糖诱导的足细胞损伤，从而加速DKD的进展[40-41]。因此，肺腺癌转移相关转录本1在糖尿病足细胞损伤和蛋白尿中起关键作用。研究表明，长链非编码RNA-SOX2重叠转录本通过刺激miR-9促进SIRT1基因的表达，从而诱导受损的足细胞自噬，减轻足细胞损伤[41]。以上研究表明在DKD状态下，完整的自噬通路在维持足细胞稳态中起重要作用，自噬功能失调，导致足细胞损伤，进而导致DKD患者产生大量蛋白尿，最终导致DKD进展为终末期肾病。

4 小 结

随着多种强化治疗方案的应用，糖尿病的发病率在世界范围内仍呈上升趋势。DKD作为一种严重的糖尿病并发症，发病率和死亡率居高不下，因此迫切需要寻找预防和治疗DKD的其他有效治疗靶点。虽然DKD的发病机制尚未完全清楚，但是足细胞自噬中的主要营养感应信号途径以及细胞内应激信号在DKD中有重要的调节作用。因此，足细胞自噬的调控机制需要进一步探索，以期为临床预防和治疗糖尿病并发症提供新的治疗靶点。