新型冠状病毒核酸与抗体检测影响因素的分析评价

刘若锦，李挥，王丽(通信作者)，张秀杰(通信作者)，张晓刚

1 河北省医疗器械与药品包装材料检验研究院 (河北石家庄 050227)；2 英诺特(唐山)生物技术有限公司 (河北唐山 063000)

新型冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus-2，SARS-CoV-2)与SARS病毒(SARS-coronavirus，SARS-CoV)有系统相似性。由于SARS-CoV-2的迅速传播，2019年冠状病毒已被世界卫生组织宣布为国际关注的突发公共卫生事件[1]。截至2020年5月5日，全球已记录有3 517 348例实验室确诊病例和243 401例死亡病例[2]。

由于感染SARS-CoV-2患者的临床表现从轻微(或无)到包括死亡在内的严重体征和症状不等[3]，因此，医学专家确诊SARS-CoV-2需要高度依赖诊断法[4]。在此，我们简要讨论SARS-CoV-2的不同检测技术，并重点讨论不同检测技术在临床检验中出现结果误判的可能原因。

1 SARS-CoV-2概述

冠状病毒是一种包被的无节段正性RNA病毒，属于原冠状病毒亚科。SARS-CoV-2、SARS-CoV和中东呼吸综合征冠状病毒(Middle East respiratory syndrome-coronavirus，MERS-CoV)均起源于β型冠状病毒。虽然一部分人感染新型冠状病毒的症状是轻微的，但其具备潜在的致命性。目前，虽然SARS-CoV-2的病死率(约6.9%)低于SARS-CoV(10%)和MERS-CoV(34%)[2,5-6]，但其传播率可能高于两者[7]。澳大利亚国立大学流行病学家梅鲁·谢尔也表示，很多SARS-CoV-2确诊病例只有轻微症状，患者表现出来的发热、咳嗽等症状在流感和其他呼吸道病毒感染中很常见，因此，医学专家确诊SARS-CoV-2病例需要高度依赖诊断法[4]。

对SARS-CoV-2的快速、准确的诊断有助于公共卫生的准确监测、疾病预防和有效的管理控制。目前，可检测病毒的技术主要针对病毒正链单股RNA、抗体等[8]。多个实验室和公司开发了不同类型的SARS-CoV-2的诊断试剂。在我国，截至目前，国家药监局批准上市的包括核酸检测试剂和抗体检测试剂在内的检测试剂共30个。虽然SARS-CoV-2检测产品的预期质量与实际质量仍存在差距，但各国政府面对全球爆发的局势正在努力提高检测能力，并且已经认识到随着为控制疫情而采取的对人群限制措施的解除，检测将在今后的病毒控制中发挥关键作用。

2 核酸检测及其影响因素

2.1 核酸检测概述

核酸检测是直接对所采集标本中的病毒核酸进行检测，用于定性检测 SARS-CoV-2疑似病例、疑似聚集性病例及其他需要进行SARS-CoV-2诊断或鉴别诊断样本中的核酸；检测过程包括标本处理、核酸提取、PCR检测等步骤，平均检测时间2～3 h；适用于咽拭子、鼻咽拭子、痰液、肺泡灌洗液样本；因其特异性强、灵敏度相对较高，是当前主要的检测手段。

目前，新型冠状病毒核酸检测分为荧光PCR法、恒温扩增-实时荧光法、杂交捕获免疫荧光法、RNA捕获探针法、恒温扩增芯片法和联合探针锚定聚合测序法。

2.2 核酸检测假阴性的影响因素[9]

2.2.1病原学

由于SARS-CoV-2是单链RNA病毒，容易在传播过程中发生变异，且人类对新型冠状病毒的研究时间尚短，因此，当病毒RNA的引物设计区域发生突变时，会直接导致核酸检测结果的假阴性。

2.2.2样本

(1)采集时间与类型：《新型冠状病毒肺炎病毒核酸检测专家共识》中指出，应采集患者发病3 d内的标本[10]进行核酸检测，但SARS-CoV-2在人体内的潜伏期为2～7 d，很多患者的病程在就诊时已经迁延了数天至数周，无法确定样本采集时是否为检测的最佳时期，亦不能确认样本内病毒载量是否仍然处在方法学的检测范围内[11]；此外，不同的样本类型，阳性率不同，例如鼻拭子优于咽拭子[12]，检测下呼吸道标本的准确性更高。(2)样本的质量：采集患者的样本应包含病毒，且病毒含量应达到核酸检测的下限，影响样本质量的因素包括采样深度不够，未成功采集到鼻腔深处含有病毒的细胞；有的患者鼻甲肥大、鼻道狭窄或者伴有鼻过敏症状，难以顺利进入鼻腔采集样本；采集过程中可能会诱发患者产生分泌物，降低样本质量；未使用专用的病毒核酸采样拭子与保存液；样本的保存时间过长或者运输中保存温度过高。

2.2.3人员操作

检测人员在核酸提取过程中需要加入病毒裂解液等试剂，操作步骤较多，任一环节的操作不当，均会影响检测结果的准确性。

2.2.4仪器设备

为了保证检测仪器、设备的准确性及检测结果的精确性，工作人员需定期检定与维护相关设备。例如，冰箱的温度会影响样本RNA的稳定性，移液器的量程不准确会导致样本的加样误差。

2.2.5试剂

在检测过程中，如果采用了不恰当的提取试剂将大大影响病毒的检出，因此，核酸扩增试剂应选择至少含SARS-CoV-2基因的两个位点(开放读码框ORF1ab、N基因或E基因)；同时，还应关注由某些试剂盒引物设计的位点欠佳带来的不利因素，应对其进一步优化。

2.3 核酸检测假阳性的影响因素[9]

检测结果的假阳性主要是由核酸污染、非特异性扩增、基线设置不合理等因素造成的。(1)核酸污染：检测中，由于在核酸提取前、提取环节、上机扩增期间等过程中均可能造成核酸的污染，因此，核酸检测实验室应独立分区、单向流通，禁止跨区域操作，同时，获取样本所用的仪器设备也要避免交叉污染。(2)非特异性扩增：主要原因是试剂盒引物设计不具备特异性，因此会形成引物二聚体或引物自身形成发卡结构，进而产生非特异性荧光，导致假阳性。(3)基线设置不合理：设置基线的作用是扣除扩增起始阶段的背景荧光信号，但如果背景信号过强，软件可能会将背景信号误认为扩增信号，这时会导致假阳性。

3 抗体检测及其影响因素[13]

3.1 抗体检测概述

SARS-CoV-2感染机体后，最早产生的是IgM抗体，但浓度低、维持时间短、亲和力较低，是急性期感染的诊断指标；IgG抗体产生的较晚，但浓度高、维持时间长、亲和力高，血清IgG阳性提示感染中后期或既往感染[14-15]。

抗体检测包括胶体金法和磁微粒化学发光法。(1)胶体金法试剂盒分为检测IgM抗体、检测并区分IgM/IgG抗体、检测但不区分IgM/IgG抗体的产品。胶体金法的平均检测时间为15 min左右，无须复杂设备，操作便捷，可目视判读结果，但其灵敏度一般低于化学发光法。(2)磁微粒化学发光法分为检测总抗体、检测IgM抗体、检测IgG抗体。该检测方法的灵敏度高，操作相对便捷，一般需要30～60 min。但需要配套的检测设备，临床推广受限于设备的普及程度。

抗体检测适用于血清、血浆和静脉全血样本，采样相对简便、样本更稳定。抗体检测是对人体血液中的抗体水平进行检测，但在疾病感染早期，由于人体内可能还未产生抗体，存在检测窗口期，且存在个体差异，因此，其可用于对核酸检测阴性的病例进行辅助诊断及对病例的排查、筛查，但不能代替核酸检测方法，即不能作为新型冠状病毒感染的肺炎确诊和排除的依据。

3.2 抗体检测假阴性

(1)防腐剂和抗凝剂：使用防腐剂、抗凝剂处理后的样本，会抑制辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)的活性，因此导致假阴性。(2)样本与试剂的保存：样本保存时间过长，即使在冰箱中，IgG也会形成多聚体，并且抗体免疫活性会大大减弱；同时，试剂未在规定的条件下储存也会影响检测结果[16]。(3)人员操作：人员操作导致的对使用前试剂在室温下平衡时间不足、试剂用量不足、试剂受到污染等，均会造成检测结果假阴性。(4)层析速度：层析速度过快，抗原抗体复合物尚未与检测线上的抗体结合，就会越出检测线，造成假阴性。

3.3 抗体检测假阳性[13]

(1)溶血或红细胞标本：红细胞内液中的多种酶可与底物发生非特异性反应，且血红蛋白中亚铁血红素可催化底物造成检测假阳性[17]；在检测区堆积形成颜色较浅的非特异性条带也会干扰目视判定的结果[18]。(2)纤维蛋白：由于离心机的转速过低或离心时间太短导致血清中的纤维蛋白未能完全析出。(3)细菌污染：细菌可能含有内源性HRP，影响结果判读[17]；此外，疏水的细菌碎片可以与金标粒子或与捕捉抗体发生结合，造成结果假阳性。(4)患者自身原因：如果患者有某些基础疾病、存在免疫功能异常或长期服用某种药物，其体内会产生蛋白抗体等自身抗体，可能会干扰检测结果，造成假阳性[19]。

4 核酸与抗体联合检测

在感染SARS-CoV-2的不同疾病进展阶段，依据核酸、IgM和IgG抗体的不同检测结果，不仅可判定患者所处的感染时期，还可通过核酸与抗体联合检测提高诊断效率[13]，更有效地进行临床检测和疫情防控。

5 结语

核酸和抗体检测的效率不尽相同，两者联合使用，可取长补短，不仅可以有效提高SARS-CoV-2的诊断准确性和时效性，还能更好地了解病毒载量和疾病进展，指导临床诊疗工作。但经临床实践证实，SARS-CoV-2的检测必须结合临床、影像学、流行病学资料进行综合分析，才能确诊SARS-CoV-2患者，因此，有必要开发更灵敏和更特异的检测技术和靶向治疗方法，以满足临床的防控需求。此外，在实际应用过程中，由于不同厂家生产的试剂盒的性能尚无评价数据，因此，对试剂盒的灵敏度、特异度及准确性等指标亟待评估。