视网膜色素上皮与近视发病机制研究进展△

2020-02-17姜倩蒋文君徐福如毕宏生

眼科新进展 2020年10期

姜倩蒋文君徐福如毕宏生

澳大利亚Holden研究团队对1995年以来发表的近视数据进行系统回顾和荟萃分析后显示，目前全球近视患病率约为28.3%，且逐年上升，预计到2050年将达49.8%[1]。中国青少年近视患病率居世界首位，2018年南京大学生和青岛学龄儿童(10～15岁)近视患病率分别为86.8%和52.0%[2-3]。近视进行性眼轴增长常伴发近视性黄斑病变、青光眼和视网膜脱离等眼科并发症，具有致盲风险，危害巨大。目前，近视发病机制尚不明确，亦无有效治疗方法。研究表明，视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)细胞可分泌多巴胺等神经递质和多种生长因子，并通过视网膜-脉络膜-巩膜信号级联及调控离子及代谢物质转运在近视的发生发展中发挥重要作用。本文就参与近视发展进程的RPE组织形态学和离子稳态变化及其分泌的相关生长因子和神经递质在近视发生发展中的作用进行综述，为阐明近视发病机制，寻找近视防控的有效方法提供新思路。

1 RPE组织形态学变化与近视的关系

RPE细胞位于视网膜神经上皮层与脉络膜之间，为单层排列整齐的六角形细胞。临床和动物研究发现，近视发生过程中RPE细胞总面积增大、视网膜赤道至后极部的中点处密度降低。使用光学显微镜对65个白种人眼球组织切片的RPE细胞计数进行研究发现，视网膜赤道向赤道后区域、赤道前RPE细胞密度随眼轴增长而降低，而锯齿缘、视网膜后极部和黄斑区RPE细胞密度与眼轴长度无相关性[4-5]。横断面研究显示，约有50.8%的高度近视患者RPE细胞发生驼峰样改变，这是由于RPE下的大脉络膜血管抬高所致，驼峰样改变多出现在晚期并发脉络膜萎缩的高度近视眼[6]。1997年，Fleming等[7]在短尾矮袋鼠形觉剥夺性近视(form deprivation myopia，FDM)动物模型中通过视网膜分区域观测研究发现，视网膜赤道部和颞侧中央RPE细胞随着近视发生发展密度降低，且视网膜周边区域RPE细胞面积轻微增大。Dong等[8]发现，透镜诱导性近视(lens induced myopia，LIM)豚鼠后极部RPE细胞密度随眼轴增长而下降，赤道部和锯齿缘RPE细胞密度与眼轴长度相关性不大。同时，动物研究进一步发现，近视过程中RPE细胞总数量保持不变。2005年钟兴武等[9]在猴FDM和LIM模型中发现，近视过程中RPE细胞排列趋于紊乱，RPE细胞向光感受器层伸出的毛刷状突起变短，细胞质内吞噬体减少，对光感受器外节膜盘的吞噬作用下降。此外，临床研究还发现，由RPE细胞分泌的Bruch膜在视网膜赤道向赤道后区域随眼轴伸长而扩大[3]，而Bruch膜厚度和黄斑区Bruch膜长度与眼轴无相关性[10]。

2 跨RPE的离子和液体运输与近视的关系

研究表明，RPE细胞通过紧密连接组成视网膜选择性通透屏障，调节离子及代谢物质转运，在眼球发育和视网膜稳态中起重要作用。RPE细胞存在的相关通道包括钾离子(K+)和氯离子(Cl-)通道可调节跨膜液体运动。其中，Cl-通道和囊性纤维化跨膜传导调节因子(cystic fibrosis transmembrane regulator，CFTR)在 RPE细胞的基底外侧，而跨膜转运的能量来源Na+-K+-ATP酶位于RPE细胞膜上，可以看出离子通道分布是不对称的，与其功能相一致。此外，RPE可通过调节视网膜和脉络膜之间的液体交换诱导脉络膜厚度变化，Zhang等[11]发现，RPE中编码Cl-转运蛋白和通道的基因NKCC(Na+-K+-2Cl-cotransporter)和CFTR在LIM鸡中相对减少，导致RPE上离子和液体转运减少，这可能是造成近视脉络膜变薄的原因。近视恢复早期在冻干法制备的RPE光感受器的外段区域中，K+、Na+和Cl-离子的浓度升高，说明近视RPE水肿可能是由于RPE的高渗透压所致，进一步证明了离子转运在近视过程中起重要作用[12]。此外，玻璃体内注射非特异K+通道抑制剂氯化钡和选择性NKCC抑制剂布美他尼均对鸡LIM发展起抑制作用，表明K+通道和NKCC转运体参与了眼球屈光控制机制[13]。以上结果均表明，跨RPE的离子和液体运输与近视发生发展密切相关。

3 RPE的神经递质及受体与近视的关系

3.1 多巴胺多巴胺(dopamine，DA)是光适应的化学信使，通过与其受体结合发挥生物学作用，包括视网膜发育、视觉信号转导和屈光发育。DA受体有5种亚型(D1～D5)，根据其生物化学和药理学特性，进一步分为D1类(D1、D5)和D2类(D2～D4)。实验性近视研究表明，FDM和LIM鸡、树鼩、豚鼠和恒河猴等的视网膜DA水平及主要代谢产物3，4-二羟基苯乙酸(3,4-dihydroxyphenylacetic acid ，DOPAC)均降低[14]。另外，DA释放还与光照强度线性相关，高照明度可部分延缓FDM鸡视网膜DA水平的下降，从而抑制近视发生发展进程[15]，流行病学调查和临床研究也证实，增加户外运动时间可能通过增加DA释放降低近视发生率[16]，以上结果均表明，DA系统与近视发生发展呈负相关。但是，也有研究发现闪烁光诱导性近视(flickering light -induced myopia，FLM)豚鼠视网膜、玻璃体和RPE中DA、DOPAC和高香草酸(homovanillic acid ，HVA)水平显著增加[18]，由此得出动物近视模型DA水平变化可能与近视造模方式有关。

DA在不同的动物模型中和不同的DA受体相结合，发挥生物学作用，其中人RPE中表达D1和D2受体[17]，小鸡RPE基底部表达D2和D3受体[18]。Luo等[14]发现，FDM和FLM豚鼠视网膜D1受体、D2受体表达均上调，FLM组中多巴胺能神经元活性和DA释放显著升高，进一步证明DA系统与近视发生发展密切相关。Zhang等[19]发现，D1受体激动剂SKF38393可抑制豚鼠FDM发展，D2受体选择性激动剂quinpirole促进豚鼠FDM发展，D2受体选择性拮抗剂sulpiride可延缓豚鼠FDM发展，而D1受体拮抗剂SCH23390不影响豚鼠FDM发展，D4受体激动剂PD168077可抑制树鼩FDM发展，表明DA及其同源受体可影响豚鼠的屈光不正[20]。FDM小鼠腹腔注射多巴胺受体非选择性激动剂阿扑吗啡可抑制近视发展，进一步研究发现敲除D1受体，阿扑吗啡不能抑制FDM发展，表明阿扑吗啡对小鼠FDM发展的抑制作用是通过D1受体发挥作用的[21]。此外，在正常视觉和光照条件下，白化豚鼠出生2周发生近视性屈光改变，而有色豚鼠仍然保持远视。Jiang等[22]进一步研究发现白化豚鼠RPE脉络膜复合体多巴胺酪氨酸酶依赖性DOPA氧化酶活性低表达，但DA代谢物DOPAC和HVA水平显著高于有色豚鼠，表明白化豚鼠RPE脉络膜复合体DA转换率更高；有色豚鼠球周注射酪氨酸酶抑制剂曲酸后，眼轴延长形成近视，表明RPE酪氨酸酶依赖性多巴胺能系统参与了豚鼠屈光发育，增强酪氨酸酶活性可能会减缓近视的发展。体外培养人RPE细胞系ARPE-19发现，DA上调RPE细胞中BMP-2的表达，可能与DA抑制近视发展有关[23]。以上结果均表明DA系统是控制近视发生发展的潜在靶点。

3.2 乙酰胆碱乙酰胆碱(acetylcholine ，ACh)受体为膜受体，可分为两大类：代谢型毒蕈碱乙酰胆碱受体(M受体)和离子型烟碱乙酰胆碱受体(N受体)。毒蕈碱受体是G蛋白偶联受体家族，在哺乳动物中包括M1～M5受体亚型。大量证据表明ACh通过与M受体和N受体结合发挥作用，与近视的形成发展密切相关。研究发现，人RPE细胞表达M1受体，豚鼠RPE细胞表达M4受体，树鼩RPE细胞表达M1～M5受体，在鸡的RPE细胞中M2、M3和M4受体亚型均有表达，表明M受体的表达具有种属特异性[24]。

临床研究和动物实验均证实毒蕈碱受体拮抗剂能控制近视性眼轴延长。临床使用体积分数0.1 g·L-1M受体非选择性拮抗剂阿托品可降低儿童和青少年近视的进展[25]。在小鸡中，玻璃体内和结膜下注射阿托品均可抑制FDM和LIM的发生发展[26]。此外，M1受体选择性拮抗剂哌仑西平和M2、M4受体选择性拮抗剂Himbacine均能抑制小鸡FDM的发展[27]。临床研究也证实哌仑西平能用有效抑制屈光度数增加和眼轴延长[28]。另有研究发现，玻璃体内注射NO抑制剂能够阻止阿托品对小鸡FDM的抑制作用，表明眼内的NO参与阿托品控制近视的发展进程[29]。Tan等[30]发现拟胆碱药卡巴胆碱呈时间依赖性增加人RPE细胞TGF-β2的表达和分泌，加入阿托品后能抑制近视细胞因子TGF-β2的上调，表明在RPE细胞中，阿托品通过阻断M受体抑制TGF-β2的表达和分泌，控制近视，影响巩膜重塑和眼轴延长。以上结果均表明M受体在近视过程中发挥了至关重要的作用。

4 RPE分泌的生长因子与近视的关系

4.1 转化生长因子转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)超家族由TGF-β家族、激活素、抑制素、缪勒抑制物质和骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)等组成。研究表明，RPE细胞具有表达和分泌TGF-β的能力。FDM小鼠RPE中TGF-β 3种亚型高表达[31]，而FDM树鼩视网膜TGF-β 3种亚型水平无明显改变，FDM诱导 5 d 后观察到视网膜TGF-β2活化减少40%，视网膜ERG没有发现TGF-β2活性相关功能改变[32]。以上结果提示TGF-β在近视过程中发挥作用具有种属特异性。

研究表明， RPE细胞TGF-β2 、TGF-β3的表达与HOXA9有关。HOXA9基因编码DNA结合转录因子，其可调节基因表达、形态发生和分化，临床和动物实验均表明近视HOXA9基因高表达；在过表达HOXA9 cDNA的小鼠RPE细胞中，RPE增殖能力增加，呈剂量依赖性增加RPE细胞TGF-β2、TGF-β3、基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)、FGF2和IGF1R表达水平，提示转录因子HOXA9可能通过增加TGF-β2、TGF-β3等近视相关因子的表达促进近视的发展[33]。研究发现，小鼠的巩膜干/祖细胞(sclera stem progenitor cells,SSPCs)具有软骨形成分化潜能，体内研究发现，FDM小鼠 RPE-脉络膜复合物TGF-β3种亚型和巩膜软骨形成相关蛋白Ⅱ型胶原蛋白(collagen 2,Col2)、α平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)水平显著增加，体外研究进一步发现，用TGF-β2处理SSPCs导致α-SMA和Col2表达水平增加，表明SSPCs诱导的巩膜软骨形成可能在近视发展中起重要作用，RPE-脉络膜复合体中TGF-β水平的增加可能在近视发展过程中诱导巩膜中的软骨形成改变[31]。

BMP是TGF-β最大亚家族，参与细胞发育，细胞增殖和细胞外基质合成，在视网膜、结膜、角膜、小梁网和视乳头均有表达。遗传研究发现，BMP-2,4基因与近视密切相关[34]。Li等[35]发现BMP-2在LIM豚鼠的视网膜表达下调，在近视恢复后上调，表明BMP-2参与哺乳动物近视的发展。LIM和FDM鸡RPE中BMP-2，4，7基因表达下调[36]，提示BMP参与眼球对离焦信号的生长调控过程，影响近视发展进程。

4.2 肝细胞生长因子肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)是具有各种生物活性的细胞因子，可以促进细胞的分裂、运动和分化，还与眼组织的生理平衡、损伤修复及相关疾病有着至关重要的关系。HGF及其受体(c-Met)在视网膜、RPE和脉络膜中广泛表达，HGF与c-Met受体结合，导致MMP的活化，消化胶原和间质的其他细胞外成分，促进细胞向器官的迁移，在巩膜重塑、眼轴增长及近视发展中发挥重要作用。一项中国汉族人群高度近视基因的研究发现，MET中2个单核苷酸多态性(rs38857 和rs10215153)与高度近视有关。仝春梅[37]发现LIM豚鼠RPE细胞HGF mRNA和蛋白表达均上调。体外研究发现ATRA可抑制兔RPE细胞的增殖，RPE细胞面积增大、突起减少、色素分散、局部分裂和活动减弱，与近视时RPE细胞的变化相似。此外，RPE细胞中HGF和MMP-2的表达随着ATRA水平的增加而增强，HGF的增加程度更大，推测HGF的增加可能促进MMP-2的增加，促进近视发展[38]。

4.3 胰岛素样生长因子胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor，IGF)是一类多功能细胞增殖调控因子，主要促进细胞的分化、增殖和个体的生长发育。田军等[39]发现FDM豚鼠后极部RPE脉络膜IGF-1、视网膜IGF-2高表达，表明IGF-1参与了FDM的形成。Penha等[40]发现鸡近视离焦4 h后，RPE细胞IGF-1R表达显著下调，约为对照眼的1/4，24 h后差异消失，而IGF-1水平并未受到显著影响。小鸡玻璃体腔7 d连续注射IGF-1和FGF-2，玻璃体长度持续增加，视网膜神经节细胞发生损伤，导致近视发生[41]。研究表明，IGF-1基因和高度近视显著相关[42]，与实验性近视模型中的结果一致，表明IGF-1能促进眼部生长和轴性近视[43]。

此外，FDM豚鼠玻璃体内注射IGF-2 ASON(反义寡核苷酸)呈剂量依赖性降低近视屈光度、眼轴长度和视网膜IGF-2水平[44]，而玻璃体内注射RhIGF-2，FDM眼近视加深，眼轴长度明显延长，而正常眼的屈光度数和眼轴长度没有影响，表明RhIGF-2促进FDM的发展[45]。

5 视黄酸

视黄酸又称全反式维甲酸(retinoic acid，RA)，是一种生物活性介导物，具有增殖、细胞分化和凋亡等功能。动物研究表明，视网膜RA水平与近视发展呈正相关[46]。王沙[47]发现LIM豚鼠视网膜色素上皮-脉络膜复合体中RA及紧密连接蛋白Zonula occludens-1(ZO-1)、Occludin均随离焦时间延长而上调，玻璃体内注射RA受体拮抗剂LE540，RA的水平、紧密连接相关蛋白的表达均降低，近视眼轴增长受到抑制，提示RA通过调节紧密连接蛋白ZO-1、Occludin变化参与近视的调控。体外培养LIM豚鼠原代RPE细胞，加入ATRA使RPE细胞跨上皮电阻和细胞通透性增加，E-钙黏蛋白、Occludin和 Claudin-1也升高，细胞屏障功能增强，提示在近视早期，RPE细胞可能存在一种负反馈机制，通过增强上皮屏障功能补偿玻璃体延长造成的RPE细胞牵拉，随着近视的进一步发展，眼轴进一步延长、上皮完整性丧失，视网膜发生变性。

体外研究进一步发现，ATRA呈时间依赖性增加人RPE细胞TGF-β2的分泌，加入磷脂酶C抑制剂U73122可抑制ATRA刺激诱导的TGF-β2分泌，而腺苷酸环化酶抑制剂SQ22536对其没有影响，提示ATRA上调RPE细胞TGF-β2的表达是通过磷脂酶C途径发挥作用的，视网膜RA可能与RPE的RA受体结合并激活PKC信号通路，刺激RPE中TGF-β2的分泌并诱导近视性巩膜重塑[48]。