金属硫蛋白调控及重金属解毒功能研究进展

樊威　焦晓磊　苏建　罗煜　苏全森　吴俊　杨海　邓语

摘要：随着现代工业的迅速发展，重金属污染问题日益严重。重金属不断在生物体内富集，对生物体的生长发育与新陈代谢产生显著危害。因此寻找安全、高效的重金属解毒物质越来越受到国内外学者的重视。金属硫蛋白（Metallothioneins，MT）是一种分子量低、广泛存在于大多数生物体内的蛋白质，具有螯合重金属离子的能力，可保护机体免受重金属危害。本文综述了MT的结构和功能，从遗传分子层面进一步阐述机体对MT基因的表达调控，旨为MT在重金属解毒领域的研究与应用提供参考依据。

关键词：重金属;金属硫蛋白;解毒功能;表达调控

中图分类号：S-3文献标识码：ADOI：10.19754/j.nyyjs.20200115002

收稿日期：2019-07-29

基金项目：四川省科技计划项目（项目编号：2017NZYZF0089）

作者简介：樊威（1990-），男，助理研究员。研究方向：水产病害;通讯作者苏建（1986-），男，助理研究员。研究方向：水产养殖。

自1957年Margashes和Vallee首次從马肾中分离出金属硫蛋白（Metallothionein，MT）以来[1]，人们陆续从其它生物上也分离得到了MT。目前，国内外对MT功能的研究发现，MT有调节生物体内金属离子、激素、细胞代谢及清除自由基等能力，且能被金属、细胞因子、细胞毒性药物等诱导产生[2]。本文对金属硫蛋白结构、解毒功能、解毒调控等研究进展和应用前景进行综述，以期为其开发应用提供参考。

1金属硫蛋白的结构

MT是硫蛋白结合金属离子后的名称，学名金属硫组氨酸三甲基内盐，是一种低分子量（6～7kDa）蛋白质。除某些酵母和细菌外，典型的MT包含20个半胱氨酸，无芳香族氨基酸及组氨酸，无二硫键[3]。哺乳动物MT一般具有2个独立结构域，部分水生生物只有单体和二聚体等不同结构形式[4]。MT可通过形成金属硫酯键选择性的结合金属离子，具有极强螯合重金属离子的能力和较高的金属含量（每分子含7～12个金属分子）。MT分子中不含a-螺旋和β-折叠，构象极为稳定，因此，具有较强抗蛋白酶消化和抗热能力。

MT氨基酸数量因物种不同而有较大差异，范围在20～100个不等。哺乳动物有60～62个氨基酸;水生动物除由59个氨基酸组成的大西洋鲑[5]、61个氨基酸组成的虹鳟和香鱼[6]以及63个氨基酸的白鲟[7]外，大部分已测序鱼类MT只含有60个氨基酸。植物氨基酸数量45～87个不等;真菌及原核生物氨基酸在数量和类型等方面存在较大种间差异。

2金属硫蛋白的分类

根据蛋白结构的不同，MT主要分为MT1、MT2、MT3和MT4 4种亚型。其中MT1有多种异构体（MT1a、b、e、f、g、h、x）[8]，MT1和MT2可由大多数哺乳动物的内脏器官诱导产生[9]。在老鼠体内和体外实验中均发现MT1和MT2的表达十分活跃，同时以肝、肾细胞为主，但MT3和MT4的基因表达却十分有限[10]。与其它MT亚型不同，MT3是MT家族中唯一具有独特生理功能的亚型，也被称作脑神经生长抑制因子，能够阻止谷氨酸和一氧化氮对小脑神经元的神经毒性作用，主要分布于星形胶质细胞，对铜离子的结合能力较强，但不能被镉或其它金属离子诱导产生[11]。MT4主要分布于皮肤、消化道等器官角质细胞及复层鳞状上皮细胞[12]。

3MT对重金属的解毒功能

MT在生物体中的表达具有普遍性和保守性，而丰富的巯基含量和重金属结合能力决定了其功能方面的多样性，目前研究一致认为，MT在重金属中毒过程中扮演着重要角色。MT对不同种类重金属亲和力不同，因此，MT对重金属的解毒能力也不尽相同。目前已发现18种金属离子能与MT结合，其中结合最为紧密的是Cu2+、其次是Cd2+和Zn2 +[13]。不同金属对MT结合位点还存在竞争和置换现象，但MT分子一旦与Cd2+或Ag+结合就很难被其它金属置换下来[14， 15]。当MT与重金属离子形成复合化合物后，可通过溶酶体从细胞质排到细胞外[16]，使机体免遭重金属毒性作用。如Cu-MT在细胞代谢过程中被氧化为无毒的聚合物形态后，伴随胆汁的分泌一起排出体外，或是变成难溶的多聚体复合物储存在溶酶体中。

3.1内源性MT的解毒功能

MT对保护大脑、肝、肾等重要器官具有极其重要的作用。Park等[17]研究发现正常小鼠与金属硫蛋白基因敲除小鼠在不同重金属离子施加条件下的死亡率差异明显，在镉、锌、汞、砷等重金属的作用下，正常小鼠死亡率显著低于金属硫蛋白基因敲除的小鼠，其中，金属硫蛋白对重金属Cd2+的解毒效果最强，因此，证明了内源性金属硫蛋白对重金属解毒的作用。

3.2外源性MT的解毒功能

研究还发现外源性MT对重金属依然具有解毒作用。李晓伟等在研究儿童铅中毒的过程中发现，外源性添加MT可显著降低铅中毒儿童血铅浓度，同时不影响其它正常金属离子浓度[18]。后续研究报道，Gzde等研究铊毒性实验时，发现给小鼠腹腔提前1h注射2.5mg/kg MT1后，注射组相比对照组铊含量在一定程度明显降低[19]。于立博等在小鼠铅中毒实验中发现，外源性给予小鼠金属硫蛋白后，高剂量干预组相对于对照组细胞损伤状况减轻[20]。

3.3MT解毒功能与重金属浓度的相关性

MT在限定范围内对金属离子具有解毒效力，但超过临界值后，机体无法产生足够MT保护自身免遭高浓度金属离子损害[21]。Ren等[22]在研究中华绒螯蟹中发现，在铜胁迫条件下，伴随重金属积累，MT表达量在第7天达到最大值后随时间延长而逐渐下降，MT应答效应趋于减弱。

4金属硫蛋白的调控

MT广泛表达于所有真核细胞和部分原核细胞胞浆中，其表达受多种方式调控，如金属离子、氧化应激、甾体激素等[23]。因此，研究MT在转录水平的调控机制，有助于更深入了解MT的解毒功能。

4.1金属离子对MT基因的调控

金属调控转录因子1（Metal-responsive transcription factor-1，MTF-1）是一种75kDa大小能够调控金属应答的锌指转录因子，只有Zn2+激活MTF-1与MT基因上的MRE结合后才能调控MT的表达。正常情况下，细胞内的MT和MTF-1处于平衡状态。Yuhui等研究发现，贫铀刺激前和刺激后给小鼠腹腔注射10mg/kg ZnSO4，均可显著降低肝脏、肾脏和脾脏的贫铀含量，降低小鼠死亡率[24]。

4.2氧化应激对MT基因的调控

氧化应激对MT的调控主要依赖于MT基因结构上游区域存在的抗氧化应答元件（ARE）及金属应答元件（MRE）。正常状态下动物机体内自由基数量处于较低水平，但当机体受到某些损伤后，氧化应激产生的活性氧自由基[25]促使细胞内Zn2+释放，进而参与MTF-1介导的调控反应。如氧化性物质可迅速诱导小鼠肝脏细胞内MTs基因的转录[26]。Kyong-Son等研究发现，给小鼠注射浓度为7.5mg Fe/kg的氮基三醋酸鐵可使小鼠肝肾中MT和MT mRNA均显著上升[27]。Kelly等发现给纤维细胞添加二硝基酚（DNP，一种解偶联剂）或抗霉素（AA，一种电子传递抑制剂）均可通过产生氧自由基引起小鼠肝脏中MT表达的升高。然而，自由基激活MT的具体作用机制还有待进一步研究。

4.3甾体激素对MT基因的调控

糖皮质激素应答元件（GRE）通过与糖皮质激素受体（glucocorticoid receptor，GR）结合，介导甾体激素的反应和调控MT基因的表达。GRE为甾体激素诱导MT所必需，可不依赖MT基因近端启动子区内的MRE起作用。将HepG2细胞的GR基因敲除，在不同处理条件下，MT的表达都将被抑制[28]。

4.4其它因子对MT基因的调控

MT基因在胞内的转录调控还可受其它因素调控，因为MT基因5上游除应答元件外，还存在可诱导性增强子[29]。这些序列包括SP-1（Selective transcription factor -1）、AP-1（Activator protein-1）和AP -2等。有研究表明，通过AP-2介导，cAMP可提高肝MT mRNA水平[30]。金属应答元件还可以与蛋白或其它因子相互作用，而这些因子对MT的表达也具有一定调节作用[31， 32]。如小鼠感染流感病毒后可通过IL-6、IL-10和IL-12等白细胞介素激活JAK-STAT信号通路，实现肝脏MT215-20倍的表达。

5展望

MT作用广泛，涉及多种生物学过程并参与机体多种重大疾病的发生，虽然金属硫蛋白的重金属解毒等生物活性功能越来越多的被开发出来，但MT研究与应用中存在的诸多限制与不足亟待解决。在今后的研究中应整合生物学相关技术和方法，进一步研究其蛋白功能、表达调控和相互作用机制，在效应机制和临床应用中给予更多关注。

参考文献

[1] Panemangalore M， Banerjee D， Onosaka S， et al. Changes in the intracellular accumulation and distribution of metallothionein in rat liver and kidney during postnatal development[J]. Developmental Biology， 1983，97（1）：95-102.

[2]Haq F， Mahoney M， Koropatnick J. Signaling events for metallothionein induction[J]. Mutation Research/fundamental & Molecular Mechanisms of Mutagenesis， 2004，533（1-2）：211-226.

[3]Blindauer C A. Metallothioneins with unusual residues： histidines as modulators of zinc affinity and reactivity[J]. Journal of Inorganic Biochemistry， 2008，102（3）：507-521.

[4]Munoz A， Petering D H， Iii C F S. The requirements for stable metallothionein clusters examined using synthetic lobster domains[J]. Marine Environmental Research， 2000，50（1）：93-97.

[5]Leong J S， Jantzen S G， Schalburg K R V， et al. Salmo salar and Esox lucius full-length cDNA sequences reveal changes in evolutionary pressures on a post-tetraploidization genome[J]. Bmc Genomics， 2010，11（5）：279.

[6]Lin C H， John J A C， Li W O， et al. Cloning and characterization of metallothionein gene in ayu Plecoglossus altivelis[J]. Aquatic Toxicology， 2004，66（2）：111-124.

[7]Doering J A， Beitel S C， Eisner B K， et al. Identification and response to metals of metallothionein in two ancient fishes： White sturgeon （Acipenser transmontanus） and lake sturgeon （Acipenser fulvescens）[J]. Comparative Biochemistry & Physiology Part C Toxicology & Pharmacology， 2015，171：41-48.

[8]Bo A， Zhang H， Zhang X， et al. Clinical signification on the expressions of metallothionein in three types cancer of woman[J]. The Chinese-German Journal of Clinical Oncology， 2008，1（1）：59-61.

[9]Sato M， Kondoh M. Recent studies on metallothionein： Protection against toxicity of heavy metals and oxygen free radicals[J]. Tohoku Journal of Experimental Medicine， 2002，196（1）：9-22.

[10]Liang L， Fu K， Lee D K， et al. Activation of the complete mouse metallothionein gene locus in the maternal deciduum[J]. Molecular Reproduction & Development， 1996，43（1）：25-37.

[11]Nagamine T， Suzuki K， Kondo T， et al. Interferon-alpha-induced changes in metallothionein expression in liver biopsies from patients with chronic hepatitis C[J]. Canadian journal of gastroenterology， 2005，19（8）：481-486.

[12]Palumaa P， Njunkova O， Pokras L， et al. Evidence for non-isostructural replacement of Zn 2+ with Cd 2+ in the β-domain of brain-specific metallothionein-3[J]. Febs Letters， 2002，527（1）：76-80.

[13]Nath R， Kambadur R， Gulati S， et al. Molecular aspects， physiological function， and clinical significance of metallothioneins[J]. Critical Reviews in Food Science & Nutrition， 1988，27（1）：41-85.

[14]張建鹏， 仲燕， 任绪义， 等. 镉诱导大鼠睾丸三种类型细胞和肝脏金属硫蛋白基因表达的研究[J]. 第二军医大学学报， 2003（2）：184-187.

[15]柴春彦， 刘国艳， 石发庆. 铜缺乏对奶牛肝脏金属硫蛋白代谢的影响[J]. 畜牧与兽医， 2002（03）：14-16.

[16]Andreani G， Kindt M， Carpene E. Metallothioneins （MTs） in marine molluscs[J]. Cellular & Molecular Biology， 2000.

[17]Park J D， Liu Y， Klaassen C D. Protective effect of metallothionein against the toxicity of cadmium and other metals（1）[J]. Toxicology， 2001，163（2-3）：93-100.

[18]李晓伟， 鲁曼. 金属硫蛋白对铅中毒儿童临床干预观察研究[J]. 中国儿童保健杂志， 2008，16（4）：391-393.

[19]Kilic G A， Kutlu M. Effects of exogenous metallothionein against thallium-induced oxidative stress in rat liver[J]. Food & Chemical Toxicology An International Journal Published for the British Industrial Biological Research Association， 2010，48（3）：980-987.

[20]于立博， 刘继文. 鹰嘴豆-金属硫蛋白拮抗小鼠骨髓干细胞铅毒性的机制[J]. 中国老年学杂志， 2013，33（23）：5930-5931.

[21]Silvestre F， Duchêne C， Trausch G， et al. Tissue-specific cadmium accumulation and metallothionein-like protein levels during acclimation process in the Chinese crab Eriocheirsinensis[J]. Comparative Biochemistry & Physiology Toxicology & Pharmacology Cbp， 2005，140（1）：39-45.

[22]Ren F， Jiang H， Sun J， et al. Cloning， characterization， expression， and copper sensitivity of the metallothionein-1 gene in the Chinese mitten crab， Eriocheirsinensis[J]. Molecular Biology Reports， 2011，38（4）：2383-2393.

[23]Lynes M A， Zaffuto K， Unfricht D W， et al. The physiological roles of extracellular metallothionein[J]. Experimental Biology & Medicine， 2006，231（9）：1548-1554.

[24]Hao Y， Ren J， Liu J， et al. The Protective Role of Zinc against Acute Toxicity of Depleted Uranium in Rats[J]. Basic & Clinical Pharmacology & Toxicology， 2012，111（6）：402-410.

[25]Ramón R， Rodrigo F G， Rodrigo G， et al. Oxidative Stress and Pathophysiology of Ischemic Stroke： Novel Therapeutic Opportunities[J]. Cns & Neurological Disorders Drug Targets， 2013，12（5）：698-714.

[26]Dalton T P， Li Q， Bittel D， et al. Oxidative Stress Activates Metal-responsive Transcription Factor-1 Binding Activity[J]. Journal of Biological Chemistry， 1996，271（42）：26233-26241.

[27]Min K S， Morishita F， Tetsuchikawahara N， et al. Induction of hepatic and renal metallothionein synthesis by ferric nitrilotriacetate in mice： the role of MT as an antioxidant[J]. Toxicol Appl Pharmacol， 2005，204（1）：9-17.

[28]Sato S， Shirakawa H， Tomita S， et al. The aryl hydrocarbon receptor and glucocorticoid receptor interact to activate human metallothionein2A[J]. Toxicology & Applied Pharmacology， 2013，273（1）：90-99.

[29]金淑梅. 水稻类金属硫蛋白（rgMT）基因功能解析及对苜蓿的遗传转化研究[D]. 哈尔滨：东北林业大学， 2006.

[30]Cousins R J. Absorption， transport， and hepatic metabolism of copper and zinc： special reference to metallothionein and ceruloplasmin[J]. Physiological Reviews， 1985，65（2）：238-309.

[31]Tang C M， Westling J， Seto E. trans repression of the human metallothionein IIA gene promoter by PZ120， a novel 120-kilodalton zinc finger protein[J]. Molecular & Cellular Biology， 1999，19（1）：680-689.

[32]Miles A T， Hawksworth G M， Beattie J H， et al. Induction， Regulation， Degradation， and Biological Significance of Mammalian Metallothioneins[J]. Critical Reviews in Biochemistry & Molecular Biology， 2008，35（1）：35-70.

（責任编辑贾灿）