间充质干细胞源性外泌体对前部缺血性视神经病变患者的治疗潜力△

李东丽 宫媛媛

基于不同细胞来源的间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)的组织修复和免疫调节作用已成为其治疗包括心肌缺血、缺血性脑卒中等在内各种组织来源的缺血性疾病最有前景的策略[1-3]。目前正在针对越来越广泛的疾病适应证进行各种动物模型研究和临床试验，而其衍生的外泌体(exosomes)因含蛋白因子、脂质体、RNA、DNA 片段等传递细胞间信号作用和特有的一些优势，从而成为再生医学的研究热点;需要特别提出的是，根据细胞类型、细胞大小、细胞所处微环境变化，外泌体的内容物成分呈差异性表达。研究证实，神经细胞及干细胞分泌的外泌体在神经疾病的发生发展进程及损伤

修复机制中起重要的调控作用[4]。因此，MSCs衍生的外泌体可能提供治疗前部缺血性视神经病变(anterior ischemic optic neuropathy，AION)和潜在的其他视网膜血管相关疾病新的安全的有效工具。

1 AION概述

AION是50岁以上患者最常见的由于后睫状动脉循环障碍造成视盘供血不足，引起视神经急性缺氧而水肿的一种病变，由于对本病的发病机制认识不充分，临床上尚缺乏疗效确切的治疗方案[5]。非动脉炎性前部缺血性视神经病变(non arteritic anterior ischemic optic neuropathy，NAION)是缺血性视神经病变的最常见形式，故以下探讨的AION均指非动脉炎性。研究显示，这种形式的病变与各种危险因素有关，包括高龄、系统性高血压、夜间低血压、糖尿病、阻塞性睡眠呼吸暂停、高脂血症等，血管活性药物的使用可能是NAION的另一个风险因素，尽管已经报道了许多血管活性药物与NAION的关联，但没有一个被证明是最终明确的因果关系，对其发病机制也知之甚少[6]。

NAION可被称为类似发生于中枢神经系统白质中的脑卒中，其通常导致严重的视力丧失，可单侧或双侧，患者通常表现出与视野缺损相关的急性、无痛性的视力丧失、相对传入性瞳孔障碍、视盘肿胀和一个或多个火焰形状的视盘周围视网膜少量出血。视力丧失在首次发生后2个月内通常保持稳定，之后逐渐发展为弥漫性或节段性视盘苍白，伴继发性萎缩。研究显示，对侧眼随访5 a内的NAION发生率为14.7%，第二眼受累的风险多为更差的基线视力或糖尿病等。NAION的组织病理学涉及缺血性水肿、海绵状变性、视神经轴突萎缩以及视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells，RGCs)凋亡[7]。药物治疗包括抗凝血药物、抗血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)药物、皮质类固醇和促红细胞生成素等，但均未确切地被证明是持续有益的[8-9]。通过口服、静脉内、玻璃体内或眼球下Tenons途径给予类固醇的长期疗效仍不确定[10]；有证据表明，视神经开窗手术无效并且可能有害[11]。因此,迫切需要寻找有效的治疗策略。干细胞疗法可以进行组织再生，目标是恢复或替换受损的视网膜脉管系统和缺氧损伤中受损和(或)退化的神经元。目前已经探索了不同来源的间充质干细胞及其衍生的外泌体作为潜在治疗工具。

2 间充质干细胞源性外泌体的发生及其生物作用

MSCs为一类具有自我复制能力和多向分化潜能的成体干细胞亚组，在修复组织损伤、抑制局部炎症和免疫调节中的治疗潜力和安全性已得到众多研究的支持。然而，使用MSCs有一些缺点，如需要具有稳定的表型，成本高和生产储存时间延迟等。此外，已经报道了其在异位组织形成、细胞排斥等中的一系列问题[12]。研究表明，MSCs可以通过直接分化和旁分泌机制将分子(如生长因子、细胞因子和细胞外微泡)分泌到周围环境中实现治疗效果；在这些旁分泌分子中，外泌体在疾病诊断和治疗中显示出重要功能[13-14]。外泌体是一种几乎可由所有类型细胞分泌到胞外空间的具有磷脂双层结构的纳米级囊泡，含有其母体细胞多种特异的结构成分及其特性。目前外泌体神经相关研究的治疗效果已广泛归因于其表面标志物、分子内容物、低免疫原性、穿过血-脑脊液屏障的能力以及介导神经再生的作用[15]。然而，与外泌体类似，间充质干细胞源性外泌体(MSC-exosomes)也携带核酸、蛋白质和脂质等复杂物质。通过质谱、抗体阵列和微阵列分析，已经在MSC-exosomes的内容物中鉴定了超过850种独特的基因产物和多于150种miRNA[16]。这些外泌体蛋白质和miRNA的功能是复杂的，并且涉及许多不同的生物化学和细胞过程，如通信、免疫调节、组织修复和再生以及代谢。这种广泛的生物活性分布赋予MSC-exosomes引发多种细胞反应，并与许多细胞类型相互作用的潜力。

3 MSC-exosomes治疗AION的作用机制

MSCs不仅具有多向分化潜能，并能分泌多种细胞因子促进血管形成，改善血流灌注和氧供，因此，MSCs一直是缺血性疾病血管再生治疗的研究热点。MSC-exosomes含有MSCs来源的细胞特异性蛋白质和核酸，能够部分模拟MSCs功能，且能透过血-脑脊液屏障，可替代MSCs治疗缺血性疾病的再血管化治疗。最近，MSC-exosomes也已经在各种神经和神经退行性疾病的治疗中显示出令人鼓舞的治疗功效，包括创伤性脑损伤、脑卒中和阿尔茨海默病等[17]。然而，在AION中，视网膜的特殊结构提供了一个更方便的位置来研究MSC-exosomes的缺血后神经修复功能和其在视网膜中的分布。MSC-exosomes成功地将营养和免疫调节因子递送至视网膜内部，并有效促进受损RGCs的存活和神经再生。外泌体在介导MSCs作为基质支持细胞的功能中起关键作用，以维持组织内的稳态并响应外部刺激。目前的各种临床试验证据显示，基于细胞疗法的MSCs不是替代受损细胞，而是通过向细胞内递送功能性蛋白质分子和miRNA信号来促进神经可塑性，促进血管生成，抑制氧化应激和纤维化，减少细胞凋亡以及起到免疫调节作用，为眼部缺血性视神经病变重塑建立适当的微环境，从而快速启动细胞修复功能。以下综述了MSC-exosomes在治疗AION相关疾病及中枢神经系统(central nervous system，CNS)中的主要作用机制，为该领域研究者进一步探索MSC-exosomes在AION的有效治疗提供依据。

3.1 促进神经可塑性视神经是由视网膜RGC轴突和支持神经胶质组成的CNS白质,这使它们容易受到创伤性和退行性疾病。ahin等[18]通过光谱域光学相干断层扫描(spectral domain optical coherence tomography,SD-OCT)检测到慢性期NAION患者眼中黄斑神经节细胞复合体和视盘周围视网膜神经纤维层厚度明显变薄和轴突损伤。虽然手术或皮质类固醇可能使一些患者受益，但由于进行性RGC轴突变性和坏死，失去的视力可能是永久性的。已证明基于细胞疗法的MSCs促进中枢神经系统的可塑性和神经血管重塑导致功能获益[19]。而MSCs通过其衍生的外泌体促进神经血管重塑，改善神经功能恢复，促进内源性神经营养因子的发生。 Mead等[20]用大鼠视神经挤压模型模拟RGC凋亡和轴突变性，玻璃体内骨髓MSC-exosomes注射后在OCT和视网膜电图下显示了RGC轴突的显著保护(以视网膜神经纤维层厚度测量)和RGC功能的保留(以pSTR振幅测量)。Zhang等[21]研究发现，骨髓MSC-exosomes促进皮层神经元的轴突生长，而携带升高的miR-17-92的MSC-exosomes进一步促进这种效应。MSC-exosomes也报道了Akt途径的激活，这是受损RGC存活和再生的主要途径[20]。总之，数据表明MSC-exosomes含有多种miRNA，外泌体成功地将物质运送到视网膜内层以及Müller胶质细胞和RGCs，并通过miRNA依赖性机制引发治疗效果[20]。RGCs的丧失或功能障碍是不可逆性失明的主要原因，而外泌体可以将生物活性核酸递送到视网膜内多层的能力表明无细胞疗法可能有益于缺血性或退行性神经眼病的治疗。

3.2 促进血管生成研究发现视网膜视盘旁和脉络膜血管密度在急性和慢性NAION患者中显著减少。 Song等[22]用光学相干断层扫描血管造影术(optical coherence tomography angiography,OCTA)检测到NAION患者视网膜毛细血管周围和视神经盘的血管密度显著低于正常组，证实了此类疾病中视网膜和视盘中的血液灌注不足和微血管的丢失。而缺血后损伤修复的关键因素之一就是血管新生。已经证明MSCs 外泌体在心肌缺血/再灌注损伤、脑损伤模型中表现出血管保护作用[23-24]。MSC-exosomes被血管内皮细胞(vascular endothelial cells,VEC)有效吸收,实验显示这些外泌体通过ERK/Akt信号刺激VEC迁移和血管形成[25]；全面蛋白质组学分析显示，MSC-exosomes表达涉及血管生成的多种因子，包括核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)、血小板衍生生长因子(platelet derived growth factor，PDGF)、表皮细胞生长因子(epidermal growth factor,EGF)和成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor,FGF)相关的信号蛋白，而NF-κB信号传导被鉴定其为诱导内皮细胞血管生成的关键介质。对促血管生成因子进行分析，发现细胞外基质金属蛋白酶诱导因子(extracellular matrix metalloproteinase inducing factor,EMMPRIN)的水平较高，敲除此基因后VEC 的促血管生成作用明显减弱。因此，MSC-exosomes强大的促血管生成作用主要是通过外泌体的基质金属蛋白酶诱导因子(matrix metalloproteinase inducing factor,MMPRIN) 实现的[26]。外泌体携带的miRNA 在MSCs介导的缺血后内皮细胞功能修复和血管生成中也起重要调控作用，Saif 等[27]研究发现，miRNA-424 通过靶向cullin 2 促进血管新生。研究证明，接触模拟缺血微环境可以提高一些促血管发生蛋白和功能性miRNA 在 MSCs及其外泌体中的表达，这些 MSCs及其外泌体含有强大的促血管再生成分，能够诱导血管再生。Moisseiev等[28]研究结果显示，玻璃体内注射来自低氧条件下培养的人MSC-exosomes能显著减少氧诱导视网膜病变小鼠模型中的视网膜缺血，并促进新生血管形成；Lv等[29]证实，在低氧条件下低氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)过表达的MSCs 分泌外泌体增强血管生成和血管通透性。总的来说，MSC-exosomes或经处理后含有较强大的血管生成旁分泌效应物有望弥补MSCs的不足，成为治疗AION及相关疾病的有效治疗策略[30]。

3.3 抑制氧化应激和减少细胞凋亡NAION患者由于短后睫状动脉灌注减少引起视神经损伤，之后导致RGCs的凋亡和视神经萎缩[31]。Dreixler等[32]已经确定，在具有急性缺血-再灌注损伤的动物眼中，玻璃体内注射MSCs导致RGC层的保存，这种效果可以通过玻璃体内注射条件培养基来复制，培养基通过减弱缺血后细胞凋亡和凋亡相关基因表达来预防缺血后视网膜细胞丢失。以往研究证明，静脉注射MSCs通过抑制细胞凋亡和减少炎症反应来挽救视网膜激光损伤，但其较少迁移到受损的视网膜，推测主要是通过分泌营养因子调节眼内微环境在神经保护中起作用。类似地，Yu等[33]进一步使用同样激光诱导的视网膜损伤动物模型比较玻璃体内注射MSC-exosomes和MSCs的效果，发现MSC-exosomes对受损视网膜的保护作用与抑制损伤、减少细胞凋亡和抑制炎症反应的程度与MSCs相当，并表明MSC-exosomes部分通过下调MCP-1改善激光诱导的视网膜损伤。此外，Xiao等[34]在大鼠氧-葡萄糖剥夺模型诱导的缺血缺氧性CNS少突胶质细胞中发现，骨髓MSCs衍生的miR-134外泌体通过负向调节caspase-8依赖性凋亡途径抑制少突胶质细胞的凋亡。因此，MSCs 衍生的外泌体部分地充当将miRNA转移到远端受体细胞的载体，改变其miRNA表达来介导受体细胞的抗凋亡功能。MSC-exosomes也能增强有益miRNA表达，刺激轴突向外生长，从而改善缺血后神经的功能恢复。

3.4 免疫调节作用研究显示，在NAION缺血性梗死后存在多核型白细胞的浸润和巨噬细胞的吞噬和清除作用，揭示了细胞免疫反应参与视神经的损伤[35]。然而，早期NAION后炎症反应可能导致持续或甚至进行性视神经功能障碍，如果发生后一种效应，针对性地减少早期炎症反应可能引起NAION患者的视力改善。Doeppner等[36]发现MSC-exosomes在小鼠中风模型中改善神经恢复，增加神经发生和血管生成，并参与了缺血后免疫反应。体内研究表明，人脐带MSCs外泌体可以通过下调炎性细胞因子如TNF-α、巨噬细胞炎性蛋白1α(macrophage inflammatory protein 1α，MIP-1α)、IL-6和γ干扰素(interferon，IFN-γ)来改善脊髓损伤后的功能恢复；有研究发现，人脐带MSC-exosomes通过减少眼内T细胞亚群和其他炎症细胞的浸润，大大降低了正在进行的实验性自身免疫性葡萄膜视网膜炎的强度，从而保护视网膜结构和挽救视网膜功能[25]。此外,MSC-exosomes也已经在创伤性脑损伤模型中进行了测试，结果表明MSC-exosomes部分通过减少神经炎症来增强新生成的内皮细胞和新形成的未成熟和成熟神经元，从而改善创伤性脑损伤后的功能恢复[24]。鉴于外泌体被认为是含有大量蛋白质、脂质、miRNA和RNA的复杂“活”结构，这些结构可能以多种方式协同作用。总之，NAION相关的炎症问题与潜在治疗有关，而MSC-exosomes不仅具有低免疫原性，而且能够激活免疫调节相关信号通路，传递miRNA至靶细胞从而维持组织稳态，因此有望在缺血性视神经病变中提供有益的治疗效果。

4 结语

NAION是一种对患者视力具有破坏性结果的常见神经眼科疾病，伴有病理生理学机制上的不明确，以及其他关于眼睛受累和治疗策略有争议的研究数据。尽管MSCs移植在再生医学中具有巨大的应用，但与活细胞相比，MSC-exosomes更稳定，可保留，可避免异基因免疫排斥、不必要的分化和小血管阻塞等风险。MSC-exosomes与MSCs非常相似地通过各种作用机制保护视神经和促进轴突再生，这在眼前部缺血性视神经病变中是一种非常有吸引力的新型非细胞治疗方法，值得进一步眼科学方面的的探索。此外，外泌体还可以作为载体提供具有现成递送能力的更集中的促进组织愈合因子的来源。然而，需要在AION模型中进一步研究以确定是否可以观察到这些外泌体的有益作用，在将该疗法转化为临床应用之前，需要额外的长期安全性信息和剂量反应评估。此外，高质量高效率的分离提纯技术和必须明确不同组织外泌体中各种生物活性物质的确切机制及其生物学效应的持续时间均仍是目前外泌体研究领域需要进一步深入探讨的问题；仔细选择最有效的组织源性外泌体和适合特定生物样品的分离技术，最终可以满足涉及外泌体诊断和治疗的临床应用的需求。