长链非编码RNA在肾癌中的研究进展

高硕泽，范光锐，杨恩广，王志平

(兰州大学第二医院泌尿系疾病研究所 甘肃省泌尿系疾病研究重点实验室 甘肃省泌尿系统疾病临床医学中心，兰州730030 )

肾细胞癌占成人恶性肿瘤的2%～3%，占成人肾脏恶性肿瘤的80%～90%[1]。近年来，我国肾癌发病率呈上升趋势，这对我国肾癌的防治提出了更高的要求。随着分子研究的发展，现代肿瘤学正在被重塑，这些研究有可能深刻影响肿瘤的管理。尤其长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)的研究正在改变人们对肾癌的理解。但是，许多因素仍然阻碍了这一目标的实现。基因表达调控机制仍是未知数，对多种分子改变、对基因调控网络的细胞后果进行建模仍是一项重大的挑战，而且靶向分子疗法并不总是为患者带来临床益处。lncRNA作为不翻译为蛋白质的RNA转录本，在定义细胞个体发育和大部分蛋白质编码基因方面比信使RNA(messenger RNA，mRNA)更具有特异性[2-3]。lncRNA通过全基因组转录调控以及与蛋白质在多种信号通路中的直接相互作用影响细胞功能。lncRNA在泌尿生殖系统恶性肿瘤中的失调，常导致多种致癌机制和治疗耐药性的产生。因此，了解lncRNA在肾癌中的作用至关重要，有利于加强对肾癌的管理。现就lncRNA在肾癌中的失调范围，lncRNA对当前和未来肾癌治疗的潜在影响以及有效融入临床实践的可能性予以综述。

1 lncRNA的生物学功能

lncRNA是长度>200个核苷酸的非编码RNA，包括非编码小RNA、干扰小RNA、Piwi相互作用RNA、核仁小RNA和核小RNA。lncRNA的明确特征之一是获得二级和三级三维结构，主要取决于沃森-克里克碱基配对[4]。这种结构使其既可以发挥基于核酸互补性的RNA相关功能，又可基于其空间构象发挥蛋白质样功能[5]。

lncRNA可以通过顺式或反式调控其靶标基因发挥作用，单个lncRNA可以通过不同的机制调控多个靶标基因[6-7]。lncRNA可以充当支架促进多蛋白复合物的形成(如染色质重塑复合物)，随后可以被激活以影响基因表达[8]；还可作为促进DNA与蛋白质相互作用的向导，在募集蛋白复合物时增强子RNA，这些复合物诱导DNA环化和靶基因的转录激活[9]。相反，lncRNA也可以通过募集转录阻遏物调节基因表达[10]；还可以充当引物，与转录中涉及的蛋白质结合，以防止其与DNA靶标结合，或者作为竞争性内源RNA(competing endogenous RNA，ceRNA)与微RNA(microRNA,miRNA)结合防止其靶基因的负调控[11-12]。lncRNA与mRNA的结合也使得内含子保留，从而促进mRNA的选择性剪接[13]。

lncRNA广泛的生物相互作用是其多功能性的关键。通过核酸和蛋白质的相互作用，lncRNA可以稳定蛋白质，激活蛋白质复合物并调节整个基因组中的基因表达[10]。在人宫颈癌细胞、人肺成纤维细胞和人包皮成纤维细胞中，有24%的lncRNA表达可以直接与多梳蛋白抑制复合体2(polycomb repressive complex 2，PRC2)相互作用，PRC2是一种调节基因表达的主要因子，在恶性肿瘤中经常失调，说明lncRNA在基因表达调控中具有重要作用[14]。lncRNA介导的转录调控也可以不依赖PRC2，意味着lncRNA存在其他调控过程[15-16]。但是，某些lncRNA是否可以翻译为功能性肽是一个新兴的问题。总之，lncRNA功能的不断发展变化，表明其是细胞机制的重要调节剂，具有影响致癌过程的潜力。

2 lncRNA在肾癌中的机制

肾癌是一种异质性疾病，通常分为透明细胞肾细胞癌(clear cell renal cell carcinoma，ccRCC)和非透明细胞肾细胞癌(non clear cell renal cell carcinoma，nccRCC)，前者占肾细胞癌的75%以上，其次是肾乳头状细胞癌、肾嫌色细胞癌和其他肾细胞癌亚型[17]。编码林道综合征(Von Hippel-Lindau，VHL)的VHL基因突变或缺失失活导致的缺氧诱导因子(hypoxia inducible factor，HIF)途径激活以及增殖和血管生成的诱导是ccRCC的驱动因素[18]，且靶向HIF激活诱导的血管内皮生长因子依赖性血管生成一直是系统治疗的基础[17]。ccRCC中其他常见的致癌机制包括染色质重塑基因的改变，如乳腺癌1型相关蛋白1(breast cancer 1-associated protein 1，BAP1)、染色质重塑因子相关因子1(polybromo-1，PBRM1)和含SET结构域蛋白2(SET domain-containing protein 2，SETD2)[19-20]，雷帕霉素途径靶点的激活和TP53的改变。大约2 000 个lncRNA在肾细胞癌中存在异常表达[21]，这些lncRNA在ccRCC中具有特征性，被认为在HIF途径的激活中具有重要作用，并参与多种致癌机制。

2.1依赖HIF途径调控 lncRNA在HIF途经中起着至关重要的作用，包括H19、肺腺癌转移相关转录因子1(metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript-1，MALAT1)、HOX转录反义RNA(HOX transcript antisense RNA，HOTAIR)和lncRNA-肾细胞癌雄激素抑制受体(suppressing androgen receptor in renal cell carcinoma，SARCC)。

H19是一种来自第11号染色体上母系印迹基因簇的lncRNA，H19的表达由胶质母细胞瘤细胞系中HIF-1α通路激活引发[22]。研究者对H19在ccRCC中的作用产生极大兴趣，但在ccRCC中HIF途径被上调。与正常肾组织相比，H19在ccRCC中上调[23]，且H19可能在ccRCC细胞中作为ceRNA起作用，以防止E2F1(一种促进细胞增殖的转录因子)的降解[24]。其他实体肿瘤的报道显示，H19与许多转录调节因子相互作用并促进参与上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)基因的表达，使H19成为恶性肿瘤的潜在治疗靶点[25]。

MALAT在ccRCC中过表达，且通过ccRCC与癌基因EZH2的相互作用在EMT的调节中起重要作用[26]。据报道，在ccRCC的背景下这种相互作用促进上皮钙黏蛋白下调和β联蛋白上调，这是与EMT相关的关键变化[27]。MALAT1还可作为ceRNA促进ccRCC细胞中的EMT，阻止miRNA介导的上皮钙黏蛋白的E盒结合锌指蛋白2转录物的降解[12]。关于转录调控机制，MALAT1被ccRCC中的转录因子FOS(一种原癌基因)上调，其激活依赖于HIF途径[27]。

HOTAIR在ccRCC细胞中显著过表达，且与ccRCC进展相关[28]。HOTAIR的致癌潜力取决于表观遗传重编程，通过与PRC2亚基的相互作用介导，人类HOX转录组的研究证明了这一点[29]。值得注意的是，HOTAIR还可能作为ceRNA促进ccRCC细胞系中HIF-1α的表达[30]。在类似的模型中，HOTAIR的过表达也与胰岛素样生长因子结合蛋白2的上调相关，从而促进增殖[31]。此外，雌激素受体β已被证明是ccRCC中HOTAIR表达的正向调节剂，是潜在的治疗靶点[32]。

lncRNA-SARCC是ccRCC中重要的多效性lncRNA。在VHL丧失驱动的ccRCC中，lncRNA-SARCC通过结合和去稳定雄激素受体(HIF途径的转录靶标)而发挥肿瘤抑制作用[33]。相反，lncRNA-SARCC在VHL野生型ccRCC肿瘤中具有致癌性，但其潜在机制尚不清楚[33]。此外，lncRNA-SARCC本身受HIF-2α调节，可与位于lncRNA-SARCC启动子中的缺氧反应元件结合[33]。

因此，肿瘤相关的lncRNA深入参与HIF途径的激活和调控，被认为是获得肾癌标志的关键辅因子，其中影响最显著的是血管生成途径。

2.2不依赖于HIF途径调控 lncARSR(一种与肝癌和肾癌相关的蛋白激酶B信号通路的lncRNA调节因子)与转录因子Yes相关蛋白1(Yes associated protein 1，YAP1)结合，促进YAP1依赖的转录程序，从而促进肾癌的侵袭和转移扩散[34]。由于YAP1促进lncARSR的表达，lncARSR和YAP1均可形成正反馈回路[34]。此外，lncARSR可以作为ceRNA促使受体酪氨酸激酶AXL和MET(一种基因)表达，从而促进增殖和血管生成；lncARSR能够通过外泌体运输传递到邻近细胞，并以旁分泌的方式执行生物学功能[35]。

此外，还有一些其他lncRNA不依赖HIF途径调控。细胞骨架调节子RNA与多个转录调节因子结合，抑制p16基因又称多肿瘤抑制基因1(multiple tumor suppressor 1，MTS1)转录，促进细胞周期激活[36]。lncRNA-SRLR(一种肾细胞癌相关的介导索拉非尼耐药的lncRNA)与细胞质复合核因子κB结合，促进其核易位，导致白细胞介素(interleukin，IL)-6的后续表达，从而激活IL-6信号转导及转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)的正反馈自分泌环，可促进炎症以及肿瘤的增殖和扩散[37]。SLINKY(一种肾癌中的生存预测性lncRNA)已被证明直接与异核核糖核蛋白K结合，后者可调节前者mRNA的加工过程，表明SLINKY是ccRCC细胞系中重要的转录调节因子[38]。MFI2-AS1(MELTF反义RNA1)在侵袭性ccRCC肿瘤中过表达，其表达与免疫应答基因的表达相关，提示MFI2-AS1可能影响肿瘤的免疫环境[39]。

另外，与正常肾组织相比，还有多种lncRNA被下调，如生长阻滞特异性转录因子5和母源性印迹基因3是两个重要的促凋亡性lncRNA，它们在包括肾细胞癌在内的实体瘤中促进p53依赖性和p53非依赖性凋亡[40-42]。lncRNA细胞黏附分子1-AS1位于编码细胞黏附分子1的基因附近，其作为肿瘤抑制因子起作用，并在ccRCC中正调节其表达[43]。神经母细胞瘤相关转录本1的下调与ccRCC的不良结局及其侵袭性临床病理特征相关[44]。

其他一些lncRNA的作用尚待研究。HIF1A反义RNA 1(HIF 1 alpha-antisense RNA 1,HIF1A-AS1)和HIF1A-AS2是位于HIF1A基因3′和5′端的反义lncRNA，其在ccRCC中转录较正常肾组织有所增加。但是，它们在ccRCC中的作用仍不清楚。研究证明，HIF1A-AS1在ccRCC核周区堆积暗示了其在核贩运中的假想作用[45]。在结肠癌细胞系模型中HIF1A-AS1的表达也显示，它由转录应激触发，并与HIF1A转录水平呈负相关，表明HIF1A-AS1在这种情况下可能对HIF1A的表达起调节作用[46]。在多种实体瘤模型中，HIF1A-AS2被证明是一种致癌基因，其中HIF1A-AS2的表达可促进癌细胞的增殖并增强其活性，可能与不良预后相关[47]。

关于lncRNA在ccRCC表观遗传调控中的潜在影响知之甚少。但是，ccRCC通常由染色质重塑基因的改变驱动，这种改变可以改变整体转录组的格局，并且通常已知lncRNA失调会影响多个基因的转录。因此，了解lncRNA表达与染色质重塑基因(如PBRM1、BAP1和SETD2)改变之间的相互作用可能对ccRCC转录组调控网络的研究有重要意义。

3 lncRNA与肾癌的诊断与治疗

由于lncRNA可以在几种体液中检测到并可以抵抗核糖核酸酶介导的降解，因此它们可能有希望成为用于筛查肾癌的生物标志物。一项基于检测血清中5种lncRNA的方法用于诊断肾细胞癌已被提出，这5种lncRNA分别为NPTN内含子转录本1、Pvt1致癌基因、CDKN1A反义DNA损伤激活RNA的启动子、磷酸酶及张力蛋白同源物假基因1和LINC00963。这种lncRNA检测方式提供了高灵敏度和特异度，可将ccRCC患者与健康个体区分开[48]。以后需要进一步验证将该工具整合到临床实践中，这可能有助于肾细胞癌的早期诊断和分型。

由于lncRNA参与多种致癌机制，因此其可能与抗肿瘤治疗的耐药性相关。抗血管生成剂是肾癌治疗的基础，但对这些药物的耐药性可通过lncRNA，尤其是lncARSR和lncRNA-SRLR介导。在细胞系模型中，lncARSR已显示出通过上调AXL和MET来增强对表皮生长因子受体、酪氨酸激酶抑制剂舒尼替尼的耐药性，特别是通过竞争性结合其各自的阻遏物miR-34和miR-449[35]。值得注意的是，外泌体的运输导致了具有生物活性的lncARSR的扩散，因此在肿瘤微环境中邻近细胞表现出对舒尼替尼的耐药性。

已发现lncRNA-SRLR可通过先前描述的机制，增强对血管内皮生长因子受体 TKI索拉非尼的耐药性，这些机制涉及lncRNA-SRLR直接结合核因子κB，并随后激活ccRCC细胞系中IL-6受体-STAT3自分泌环。然而在该自分泌环中，IL-6引起的STAT3磷酸化由IL-6受体和表皮生长因子受体共同介导。这种共激活导致对IL-6信号的细胞质调节剂不敏感，后者仅通过IL-6受体起作用[49]。该机制可能促进导致索拉非尼耐药的表型，因此lncARSR和lncRNA-SRLR的研究可能为克服肾癌抗血管生成疗法的耐药性提供帮助。

此外，靶向lncRNA的另一种方法是使用反义寡核苷酸干扰RNA。这些寡核苷酸能够识别lncRNA的序列，阻断lncRNA与其靶标的相互作用，还可通过核糖核酸酶H或RNA诱导的沉默复合物的识别，加工诱导lncRNA的降解[50]。然而，关于用该方法靶向lncRNA的挑战仍然很多。值得注意的是，准确的体内递送很重要，各种递送方法正在开发中，以将治疗性寡核苷酸携带到癌细胞的细胞质中为主，包括病毒载体、多聚体(基于聚合物包衣)和脂质复合物(基于阳离子脂质体)[51-52]。这些方法可以保护干扰RNA免于细胞外降解，并且有助于进入细胞质。局部给药可确保药物的递送效率，且副作用少，如其他基于病毒的治疗方法(黑色素瘤中的溶瘤免疫治疗方案)[53]。但是，在多系统肿瘤并存的情况下，药物需要全身递送，这时应评估每种癌症亚型的正常组织和肿瘤分布。此外，在以后的早期临床试验中，使用这些方法时应仔细监测不良事件，其主要原因为lncRNA及其网络具有广泛的生物学功能，但目前对其研究尚不清楚，可能会导致意外的不良事件。

4 小 结

鉴于lncRNA参与多种致癌机制，lncRNA的研究将是提高临床对肾癌生物学的理解和对肾癌进行早期诊断的关键。此外，针对lncRNA的靶向分子药物可能是一种有前景的新型肾癌治疗方法。然而，关于lncRNA致癌机制的可用信息在肾癌中仍然较分散，如果调节机制受到细胞环境的影响，这可能是一个问题。lncRNA表达的肿瘤内异质性也是未知的，可能影响肿瘤亚克隆的行为。肾癌中lncRNA的生物标志物研究为其在临床实践中的实施奠定了基础。现在需要对这些基于lncRNA的研究进行验证，并根据前瞻性试验的结果来衡量其临床相关性。因此，lncRNA是有前途但具有挑战性的工具，可以深远影响肾癌的管理。将lncRNA实施到常规临床实践中，能为精准医疗的发展提供帮助。