肿瘤获得性免疫抵抗微环境的研究进展

张浩楠，张林枝,2，高炜，杨雪玲，邢文阁，司同国

(1.天津医科大学肿瘤医院介入治疗科 国家肿瘤临床医学研究中心 天津市“肿瘤防治”重点实验室天津市恶性肿瘤临床医学研究中心，天津 300060； 2.解放军总医院第五医学中心介入科，北京 100039)

免疫检查点抑制剂的出现为肿瘤治疗格局带来了革命性的变化，虽然已在部分类型的肿瘤治疗中取得成功，但其耐药问题限制了疗效与应用，仍有部分患者免疫治疗无效，或初始免疫治疗有反应，而随着治疗周期的延长使疾病产生耐药抵抗出现疾病进展。免疫反应耐药机制错综复杂，同时受多种分子机制与肿瘤介导的免疫微环境的调控。Sharma等[1]将免疫治疗的耐药模式分为三类：①原发性耐药，肿瘤对于初始免疫治疗无反应；②适应性耐药，免疫系统能够识别肿瘤，但是肿瘤能通过适应免疫攻击保护自己；③获得性耐药，肿瘤最初对免疫治疗有反应，但一段时间后出现疾病复发或进展。

在肿瘤获得性耐药过程中，肿瘤细胞通过细胞交互作用与不断分泌可溶性的免疫抑制因子构建肿瘤免疫抑制网络[2-4]。如癌细胞可通过减少新抗原和抗原呈递分子的表达，逃避免疫记忆细胞的监视作用与免疫效应细胞的攻击[5-8]。癌细胞可释放相关因子介导免疫抑制并促进肿瘤生长和转移。癌细胞还可通过自分泌或旁分泌信号上调免疫检查点的表达，进而增加免疫抑制细胞的招募与激活[9]。非免疫细胞和肿瘤细胞之间的交互作用对免疫抑制具有重要作用。现对免疫抑制细胞和分子网络在获得性免疫抵抗中的作用予以综述。

1 肿瘤免疫微环境中的细胞构成

1.1调节性T细胞(regulatory T cells，Tregs细胞) Tregs细胞是CD4+T细胞的免疫抑制亚型，其通过抑制抗肿瘤免疫应答促进肿瘤进展。研究发现，黑色素瘤、胰腺癌及其他实体瘤内Tregs细胞增加与预后不良呈正相关[10]。瘤内Tregs细胞具有高度活化和免疫抑制作用；Tregs细胞通过抑制细胞毒性CD8+T细胞和效应CD4+T细胞的活化，并通过不同方式限制其增殖和存活。

1.2调节性B细胞(regulatory B cells，Bregs细胞) B细胞也可以通过增强或抑制抗肿瘤免疫来发挥免疫抵抗作用。新出现的B细胞亚群Bregs细胞与炎症、自身免疫和肿瘤进展有关[11]。与经典B细胞不同，Bregs细胞通过释放抗炎细胞因子[如白细胞介素(interleukin，IL)-10]抑制细胞毒性CD8+和CD4+效应T细胞(effective T cells,Teffs)活性，并通过表达共抑制分子程序性细胞死亡配体1(programmed cell death-ligand 1,PD-L1)，从而负性调节免疫反应[12]。

1.3肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophages,TAMs) TAMs是在实体瘤中检测到的最丰富的细胞类型，且是协调免疫抑制的成分之一[13]。它们表现出交替活化的表型(M2表型)[14]，巨噬细胞通过该表型释放抗炎细胞因子并表达共抑制分子PD-L1。TAMs通过分泌基质金属蛋白酶增强肿瘤生长，并通过释放促血管生成因子诱导血管生成[13]。肿瘤浸润性TAMs的数量与癌症患者预后不良呈正相关[15]。

1.4髓源性抑制细胞(myeloid-derived suppressor cells，MDSCs) MDSCs是一类具有异质性、且处于不同分化阶段的骨髓前体细胞群。肿瘤中，MDSCs的数量与预后不良呈正相关[16]。肿瘤细胞、活化T细胞和肿瘤基质细胞释放的细胞因子、生长因子的不同组合负责诱导和活化MDSCs。MDSCs数量的增多与肿瘤内CD8+T细胞浸润数量的减少、Tregs细胞浸润数量的增多有关，并增加免疫抑制介质(如前列腺素E2)的产生，以及精氨酸酶-1和诱导型一氧化氮合酶表达，同时抑制T细胞进入肿瘤[17-19]。

1.5肿瘤相关肥大细胞(tumor-associated mast cells，TAMCs) 肿瘤中，浸润性肥大细胞数量与预后不良表现呈正相关[20]。肿瘤基质和免疫细胞释放的趋化因子将肥大细胞募集到肿瘤微环境(tumor microenvironment，TME)中，如CXC趋化因子配体12[chemokine (C-X-C motif) ligand 12，CXCL12]、促血管生成因子、血小板衍生生长因子、成纤维细胞生长因子和前列腺素E2[21]。可通过不同机制激活TAMCs的发生：①免疫球蛋白E介导的激活途径；②TME的缺氧条件；③肿瘤间质和浸润性免疫细胞在TME内分泌的相关分子；④激活Toll样受体的肿瘤部位的组织损伤触发[21]。部分活化的TAMCs以自分泌方式释放CC趋化因子配体5和白细胞介素(interleukin，IL)-33，进一步将肥大细胞募集到肿瘤部位[21]。活化的TAMCs可通过释放大量生长因子和蛋白水解酶加强免疫抑制。

1.6肿瘤相关树突状细胞(tumor-associated dendritic cells，TADCs) 树突状细胞(dendritic cell,DC)是在所有组织类型中均可以发现的异质细胞群，其作为抗原呈递细胞，在许多病理条件下驱动T细胞活化[22]。由于DC的异质性，不同的DC亚群可以在相反方向上协调抗肿瘤免疫应答，促进或抑制细胞毒性和Teffs的活化[23]。TADCs的表型在肿瘤生长的不同阶段转化，可从免疫刺激表型(在肿瘤的早期阶段)转变为晚期免疫抑制表型[22-23]。TADCs可抑制细胞毒性CD8+T细胞的活化，如通过表达T细胞免疫球蛋白和黏蛋白结构域-3(T cell immunoglobulin and mucin-domain containing-3，TIM-3)和PD-L1，并释放IL-10和转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)[24]。

1.7肿瘤相关成纤维细胞(cancer associated fibroblasts，CAFs) CAFs是实体瘤中主要的基质细胞之一[25]。正常驻留的成纤维细胞接受TME内的低氧条件或来自邻近肿瘤细胞的信号刺激而转化为CAFs[26]。CAFs与肿瘤获得干细胞表型、细胞外基质降解、肿瘤侵袭和转移、血管生成以及细胞毒性CD8+T细胞凋亡等过程密切相关[27]。

1.8肿瘤血管内皮细胞(tumor vessel endothelial cells，TECs) 新生血管的形成为肿瘤细胞提供氧气和营养[28]。由于肿瘤过度生长导致的氧耗增加诱导TME内的缺氧，进而产生大量促血管生成因子(血小板衍生生长因子和成纤维细胞生长因子)。与正常内皮细胞不同，TECs表现出形态异常，使肿瘤细胞从原发部位向远处部位转移[29]。TECs释放血管生成因子并作用于邻近的肿瘤细胞以刺激其生长和侵袭[30]。

2 TME内细胞和相关因子网络介导免疫抑制

免疫抑制微环境中的免疫细胞、间质细胞、内皮细胞和癌细胞通过释放大量分子(包括生长因子、抗炎细胞因子、血管生成因子、蛋白水解酶和趋化因子)以及在细胞表面表达抑制性分子相互沟通，构建免疫抑制网络并通过自分泌或旁分泌信号通路维持正反馈，促进免疫逃避。

2.1免疫细胞的交互对话 TME内免疫细胞之间的交互对话是肿瘤介导的免疫抑制因素之一。Tregs细胞和TAMs之间的对话产生正反馈回路，进一步在微环境内招募免疫抑制细胞并表达免疫抑制分子削弱抗肿瘤免疫应答。Tregs细胞通过细胞接触或释放IL-10来诱导单核细胞分化成M2表型巨噬细胞[31]。同时TAMs释放IL-6，间接与IL-10共同诱导Tregs细胞活化，并分泌CC趋化因子配体[chemokine(C-C motif)ligand,CCL]-22以刺激CC趋化因子受体4+Tregs细胞进入肿瘤[15,32]。TAMs衍生的IL-6诱导肿瘤细胞产生转录激活蛋白介导的IL-10，进一步升高TME内的IL-10水平，有利于Tregs细胞的活化和积聚[33]。Tregs细胞、TAMs和MDSCs协同作用通过增加腺苷的水平来增强肿瘤网络的免疫抑制活性，腺苷抑制细胞毒性和Teffs的活性并诱导其凋亡[34-35]。在胰腺癌小鼠模型中，Jang等[36]表明,肿瘤内细胞毒性T细胞相关蛋白-4(cytotoxic T lymphocyte associated protein-4,CTLA-4)+Treg细胞与TADCs的相互作用诱导TADCs表达吲哚胺2,3-双加氧酶(indoleamine 2,3-dioxygenase，IDO)抑制CD8+T细胞活性。从乳腺癌小鼠模型中分离的MDSCs使用共培养系统可以改变B细胞的表型，使Bregs细胞表达PD-L1并分泌IL-10，通过分泌高水平的IL-10和TGF-β，Bregs细胞能通过诱导 Tregs细胞的聚集增加其免疫抑制能力[37-38]。PD-L1+Bregs细胞可与程序性细胞死亡受体1(programmed cell death receptor 1,PD-1)+Tregs细胞相互作用以促进Treg细胞扩增抑制抗肿瘤免疫应答[39]。

有学者对Tregs细胞与TME内肥大细胞之间的相互作用进行研究，通过使用B淋巴瘤的小鼠模型证明Treg细胞衍生的IL-9将肥大细胞募集到肿瘤部位[40]。肥大细胞刺激Tregs细胞分泌IL-9，进一步扩增Tregs细胞在肿瘤部位的积聚并维持免疫抑制。肥大细胞或TAMCs可促进单核细胞向TME的转运，并释放CCL-2和5-脂氧合酶诱导其分化为MDSCs抑制免疫效应细胞的活性[41]。TME内的肥大细胞与MDSCs的共同作用形成的反馈回路增强了免疫抑制的状态[20,41]。

2.2免疫细胞与非免疫细胞的交互对话 TME内免疫细胞和非免疫细胞之间的通信也有利于肿瘤介导的免疫抑制。肿瘤细胞释放分子以刺激Tregs细胞向肿瘤部位的运输，如肿瘤细胞通过释放CXCL-2、细胞因子IL-6增加Tregs细胞在肿瘤基质中的浸润。肿瘤细胞表达IDO并释放腺苷以抑制Teffs的活化并诱导其凋亡[42]。腺苷还可以增强Tregs细胞的抑制活性，促进肿瘤生长、转移和血管生成[43-44]。Tregs细胞与凋亡Tregs细胞可上调腺苷水平，从而放大TME内的免疫抑制信号，促进肿瘤进展和免疫逃避。肿瘤细胞逃避抗肿瘤免疫并支持其生长和转移的另一种机制是通过释放外泌体。肿瘤细胞来源的外泌体作用于TME内的靶细胞促进上皮-间充质转化，并促进肿瘤增殖[45]。

CAFs与肿瘤细胞之间的相互作用导致IL-6分泌增加肿瘤内Tregs细胞的浸润数量并通过释放TGF-β以增强肿瘤免疫抑制状态[46-47]。TGF-β可作用于正常的常驻成纤维细胞并刺激其分化为CAFs，同时扩展肿瘤的免疫抑制网络并增加TME内CAFs和Tregs细胞的数量[48]。Camp等[49]使用共培养系统证明了这种相互作用可上调细胞因子(IL-8和IL-6)、趋化因子(CXCL-1和CXCL-3)和TGF-β，这些分子参与细胞迁移并诱导上皮-间充质转化。肿瘤细胞还可以通过释放可溶性因子，通过细胞间接触手段刺激血管生成和肿瘤转移，诱导刺激 TECs和CAFs产生，以及促进细胞外基质蛋白酶的释放[50]。

Kuen等[51]研究表明，胰腺癌细胞和成纤维细胞之间通过体外相互作用释放免疫抑制分子，诱导TAMs样巨噬细胞(M2表型)的分化。研究发现，间充质样乳腺癌细胞和TAMs样巨噬细胞之间的对话能够产生正反馈回路，通过释放CCL-18和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子持续诱导上皮-间充质转化[52]。在结直肠癌小鼠模型和体外实验探索中发现TAMs和癌细胞之间存在交互作用，如通过循环肿瘤细胞分泌IL-6和抑制非受体型酪氨酸蛋白激酶，转录激活蛋白通路介导肿瘤免疫抵抗，显示TAMs在促进循环肿瘤细胞从原发肿瘤向远处迁移中的关键作用，同时CCL-2的分泌进一步增强TAMs的积累，因此TAMs和循环肿瘤细胞之间的正反馈作用能增强免疫抑制活性[53]。

3 肿瘤诱导的获得性耐药相关机制

肿瘤诱导的免疫抑制是获得性免疫抵抗的原因之一，肿瘤和非肿瘤细胞介导的复杂信号网络通过增强免疫抑制细胞的积聚、细胞因子的分泌和免疫抑制分子的表达等多种形式，改变TME中浸润淋巴细胞的组成与功能，进而产生免疫抵抗。

3.1免疫检查点的上调 一个免疫检查点的阻断可以增加免疫细胞上其他免疫检查点的表达，可能是由TME的组分触发并导致获得性抵抗。如在抗PD-1单克隆抗体治疗后，在小鼠头部和颈部鳞状细胞癌的模型中报道了TIM-3可上调肿瘤内CD8+T细胞的含量[54]。在另一项研究中，TIM-3对CD8+T细胞和Tregs细胞的上调与小鼠头颈癌模型中获得性PD-L1阻断抗性有关，然而抗TIM-3和抗PD-L1单克隆抗体联合放疗的使用导致肿瘤消退与持久的抗肿瘤免疫反应相关[55]。总之，TIM-3+T细胞的出现限制了使用抗PD-1/PD-L1单克隆抗体的疗效。因此，合理地将抗TIM-3单抗与靶向PD-1/PD-L1的单抗联合应用，可以增强疗效并在出现免疫抵抗的患者中诱导持久的反应。

小鼠卵巢癌模型中，抗CTLA-4或抗PD-1单抗与CD8+T细胞上淋巴细胞活化基因3(lymphocyte-activation gene 3，LAG-3)的上调相关[56]。CTLA-4、LAG-3或PD-1、LAG-3的联合抑制通过增加CD8+T细胞的数量和减少肿瘤中的Treg细胞来增强疗效[56]。同样，T细胞免疫球蛋白和免疫受体酪氨酸抑制模体结构域蛋白的上调可能会抵抗免疫治疗，T细胞免疫球蛋白和免疫受体酪氨酸抑制模体结构域蛋白阻断可改善免疫治疗对小鼠肿瘤的疗效。用抗CTLA-4单抗治疗的前列腺癌患者中T细胞活化的免疫球蛋白抑制Ⅴ型结构域(Ⅴ-domain immunoglobulin suppressor of T-cell activation，ⅤISTA)的水平升高，表明ⅤISTA在免疫细胞上表达的增加可能是代偿性免疫抵抗的部分机制[57]。此外，仅可在TME内的Tregs细胞上观察到ⅤISTA上调，表明其在调节肿瘤内Tregs细胞功能中的潜在重要性[58]。ⅤISTA与其配体的结合导致诱导Tregs细胞的分化。阻断小鼠肿瘤中的ⅤISTA增强了Teffs的积累和活化，并减少Tregs细胞和MDSCs的浸润。

3.2免疫抑制细胞和分子水平增加 免疫抑制细胞(TAMs、MDSCs和Tregs细胞)的募集和积累不仅可以增强肿瘤介导的免疫抑制，还可以降低肿瘤对免疫治疗的敏感性[59]。在小鼠肿瘤模型中，凋亡性Tregs细胞负责增加细胞外腺苷的水平以抑制Teffs增殖[34]。免疫治疗诱导的抗肿瘤免疫应答也可受到TME内释放的可溶性介质调节。肿瘤浸润性免疫细胞可产生大量抑制因子[16]，包括趋化因子、细胞因子、生长因子和蛋白酶。免疫抑制分子，如TGF-β和IL-10抑制主要组织相容性复合体-Ⅱ分子的表达并抑制Teffs的增殖、分化与效应功能[60]。TGF-β和IL-10通过促进Tregs细胞的分化和扩增，诱导MDSCs在肿瘤中的聚集，从而减少TME内CD8+T细胞的数量，产生免疫抑制介质[61]。肿瘤细胞和一些DC亚群可以通过表达高水平的IDO抑制细胞毒性T细胞的杀伤功能。Ninomiya等[62]证明了淋巴瘤细胞中的IDO表达能够抑制嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(chimeric antigen receptor T-cell immunotherapy，CAR-T)响应CD19识别的活性，减少CAR-T扩增和增殖，并诱导细胞凋亡。另一项研究显示，肿瘤引流淋巴结中IDO + DC诱导Teffs转变为Tregs细胞，Tregs细胞通过CTLA-4和B7配体的相互作用进一步上调DC中的IDO表达产生正反馈环，维持IDO介导的免疫抑制[63]。肿瘤引流淋巴结中的DC能够通过诱导相邻IDO阴性DC中的IDO表达放大免疫抑制，这种现象称为旁观者抑制[64-65]。在使用免疫治疗时对调节免疫细胞的关键酶及其分泌的负性因子联合阻断，可以提高部分患者的疗效。

3.3靶抗原的丧失 肿瘤细胞进展过程中不断诱导免疫逃逸，导致表观遗传学的改变，这些变化会导致新抗原的丧失，这将降低免疫细胞对肿瘤抗原的识别，从而产生获得性抵抗、降低抗原特异性T细胞的反应性并降低肿瘤对治疗的敏感性。此外，肿瘤细胞获得的表观遗传变化可以抑制抗原加工与呈递，以及T细胞活化等涉及不同肿瘤免疫应答起始、增殖、效应阶段[4,59-66]。高突变负荷和增强的新抗原数量与对免疫检查点抑制剂的反应呈正相关[67-69]。由于免疫治疗的筛选性，将不表达新抗原的肿瘤细胞不断筛选，形成亚克隆基团，该基团将对免疫治疗产生耐药抵抗。

4 小 结

TME细胞和分子组成随着不同类型的肿瘤以及肿瘤发生发展的不同阶段变化，部分实体瘤中具有肿瘤高突变负荷和免疫细胞炎性浸润的患者可以在单用免疫检查点抑制剂治疗时获益。然而肿瘤细胞通过不断改变表面分子表达、分泌可溶性分子以将免疫抑制细胞募集到肿瘤部位，抑制Teffs的增殖和功能，并诱导CAFs和TECs的分化介导肿瘤免疫抑制并抵抗免疫肿瘤反应，这些细胞交互网络促进肿瘤生长和转移。最初对免疫疗法起反映的癌症患者具有获得性抵抗的可能性。决定免疫检查点抑制剂疗效的因素包括所选靶标的免疫原性、T细胞运输到肿瘤部位的介质与能力，以及效应细胞在肿瘤部位的活性与持久性。

鉴于肿瘤免疫学状态的异质性，使用个性化诊疗方案对患者进行分层，必须根据肿瘤的免疫学状态进行评估，分析肿瘤突变负荷图谱为患者设计合理的免疫治疗方案，进一步提高免疫治疗的客观应答。