干细胞移植治疗肌萎缩侧索硬化的研究进展

张文沫，丰宏林

(哈尔滨医科大学附属第一医院神经内科，哈尔滨 150001)

肌萎缩侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)是一种破坏性神经退行性疾病，累积上、下运动神经元，其特征为运动神经元的丧失，可导致进行性肌肉无力和萎缩、呼吸衰竭和死亡，疾病进展通常较快，平均生存期为症状出现后2～3年，发病率达1/100 000～2/100 000[1]，目前其发病原因及发病机制尚不清楚，存在自身免疫、氧化应激、兴奋毒性、神经炎症等多种假说，许多环境因素(如吸烟、重金属或杀虫剂、辐射和某些类型的体育活动)也被认为可能与ALS的神经病理学改变相关[2]。ALS主要分为散发性ALS(sporadic amyotrophic lateral sclerosis，sALS)和家族性ALS(familial amyotrophic lateral sclerosis，fALS)两种类型。10%～15%的fALS与人类染色体30多个区域的大量基因突变有关，其余85%～90%的fALS病因不明[3]。现已发现，超氧化物歧化酶1(superoxide dismutase 1，SOD1)[4]、TARDBP[5]、FUS[6]、OPTN[7]、VCP[8]、UBQLN2[9]、C9orf72[10]和TBK1[11]等20多种基因与ALS相关，且遗传和非遗传因素均在ALS发病中起作用。

为了寻找ALS的治疗药物以及延缓疾病进展，学者开展了许多针对ALS的动物模型实验和临床前人体试验，但迄今为止还没有真正的突破。美国食品药品管理局批准利鲁唑(阻止过量神经传递的神经保护药物)和依达拉奉(抗氧化剂)用于ALS的治疗[12]。利鲁唑是首个获批用于ALS治疗的药物，与安慰剂相比，利鲁唑治疗ALS患者的预后显著改善[13]。依达拉奉是一种自由基清除剂，被批准用于脑栓塞的治疗。依达拉奉的第三阶段临床试验(MCI186-19研究)证实，其能够抑制ALS患者运动无力的恶化，并能显著改善ALS功能评分量表评分。有数据显示，ALS患者早期开始依达拉奉治疗的效果更好[13]。

以干细胞为基础的治疗是目前神经退行性疾病治疗的研究热点。细胞治疗通过移植新的神经元替换退化或死亡的神经元，使干细胞或祖细胞以某种方式在体内分化为所需的细胞类型。现就干细胞移植治疗ALS的研究进展予以综述。

1 间充质干细胞

间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是来源于中胚层的多能干细胞，可来源于新生儿和成人的多种组织，如脐带血[14]、脐带组织[15]、骨髓[16]、脂肪组织[17]和口腔组织[18]。MSCs移植作为多种组织和器官疾病的治疗方案，在动物模型实验和人体试验中得到了证实，包括缺血性脑损伤[19]和神经退行性疾病[20]。目前，鞘内注射和静脉注射骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)的Ⅰ期试验尚无相关不良反应的报道[21]；此外，注射脂肪来源MSCs的相关试验也较安全[22]。已有研究表明，将人或啮齿动物来源MSCs移植至标准SOD1突变体SOD1G93A小鼠，能明显改善运动功能和延长寿命，与0.9%氯化钠注射液组相比，MSCs组小鼠四肢的运动活性和运动功能更好，体重下降速度减慢，平均寿命延长[23]。对ALS患者进行早期观察和0期自体MSCs移植实验的研究表明，椎管内注射自体MSCs的耐受性良好，且未出现不可逆的手术相关不良反应[24-26]，随后的Ⅰ期试验和长期随访均证明了其安全性[27-28]。

近年来，越来越多的研究对大量受试者进行了更详细的试验。有文献报道，与标准对症治疗(如神经代谢药物)对照者相比，接受MSCs移植ALS患者的疾病进展缓慢，尤其是假性延髓麻痹和呼吸系统疾病，可见MSCs移植能够提高ALS患者的生活质量[29]。有学者将37例BMSCs移植ALS患者分为“应答者”和“无应答者”两组，结果显示前者ALS功能评分量表评分的降幅明显较小[30]。另有研究使用培养中分化的BMSCs增强神经营养因子的分泌，将这些细胞肌内联合鞘内注射给14例患者，与移植前3个月的磨合期相比，BMSCs移植后6个月的随访期内ALS功能评分量表评分和用力肺活量下降程度均减少[31]。由此可见，BMSCs移植可改善ALS患者的临床症状。

研究表明，MSCs在培养中的神经元转分化是可以实现的[32]。将BMSCs或表达神经营养素受体细胞移植到中枢神经系统中时，其可表达神经元或胶质标志物[33]。有报告显示，移植的MSCs可表达多个运动神经元标志物，表明MSCs可分化为运动神经元样细胞[34]。MSCs移植治疗可能通过延长受损运动神经元的生存时间以及保存现有运动回路来发挥作用，可以通过以下几种方式实现。

1.1MSCs分泌神经营养因子的旁分泌效应 表达脑源性神经营养因子和神经生长因子的人MSCs均能促进运动神经元的存活[35]。人脐带MSCs能够分泌脑源性神经营养因子、神经生长因子、神经营养因子3、血管内皮生长因子、胰岛素样生长因子-1、胶质细胞源性神经生长因子(glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF)6种不同的神经营养因子，这些分泌因子单独或联合均可以旁分泌的方式促进病变运动神经元的存活[36]。

1.2MSCs对外周血T细胞的免疫调节作用 几乎所有的神经退行性疾病均伴有一定程度的炎症反应，ALS的发生和发展与循环免疫细胞以及中枢神经系统中免疫细胞诱发的神经炎症有关[37]。炎症抑制调节性T细胞(regulatory T cell，Treg细胞)水平与ALS疾病进展和严重程度相关是循环免疫细胞影响ALS发病及进展的重要发现之一[38]。在病情进展迅速的ALS患者中，Treg细胞数量以及Treg细胞表达的重要标志物叉头样螺旋转录因子3的水平均降低，且Treg细胞数量与疾病进展速度呈负相关[39]。MSCs与ALS患者外周血单核细胞共培养时，γ干扰素、白细胞介素-4、白细胞介素-10等抗炎细胞因子水平升高，Treg细胞诱导增强[40]；此外，MSCs的免疫调节能力明显由固有免疫介导的Toll样受体介导[41]。因此，随着外周免疫细胞向中枢神经系统浸润，MSCs移植诱导的Treg细胞潜能显得尤为重要。

1.3MSCs对胶质细胞介导神经炎症的潜在调节作用 除外周免疫细胞外，MSCs还可以调节中枢神经系统胶质细胞的固有免疫反应。非神经元细胞自主性因素是ALS的重要病理学特点，而中枢神经胶质细胞对运动神经元的死亡起着至关重要的作用。小胶质细胞相当于中枢神经系统的外周免疫细胞，几乎与所有的神经退行性疾病有关[42]。活化的小胶质细胞在神经元保护和损伤中起重要作用。MSCs对小胶质细胞活化具有调节作用。在小鼠小胶质细胞系的实验模型中，MSCs通过可溶性因子(如转化生长因子-β)减少脂多糖刺激下的小胶质细胞炎症反应和增殖[43]，且在动物ALS模型中移植人MSCs可以调节疾病环境中的神经炎症反应[44]，但其影响机制尚待深入研究。

在以细胞为基础的移植治疗中，移植细胞的存活和复制至关重要，且中枢神经系统环境的恶化不利于移植MSCs的存活。此外，人类受体中的移植MSCs的进一步追踪和长期复制潜能(包括肿瘤发生潜能)的监测尚未实施。非侵入性技术的发展，如基于近红外线的发光探针标记移植细胞成像[45]，可能更好地实现对MSCs的追踪。未来MSCs的相关发展对于ALS甚至任何基于干细胞的治疗平台均至关重要。

2 诱导多能干细胞

诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)也是一种自体细胞来源的诱导型多能干细胞，可分化成多种细胞类型，如特异性运动神经元细胞，在ALS等退行性疾病的治疗方面具有巨大的应用前景[46]。Sareen等[47]利用人类成纤维细胞系进行的临床前研究证明，iPSCs衍生细胞可以移植并整合到大鼠脊髓中。另有文献报道，iPSCs人类白细胞抗原特征的iPSCs数据库可能代表了一种很有前景的技术，可获得高质量细胞产物，并可降低移植物排斥反应的风险，且人iPSCs在ALS啮齿动物衍生神经干/祖细胞移植的应用中显示出一定程度的疗效[48]。此外，将iPSCs分化为类似中枢神经系统的结构，即脑器官，不仅为人类大脑发育和疾病再现的研究提供了机会，还为细胞移植提供了新的来源。现已成功尝试将人脑器官移植至啮齿动物脑内，植入后的微型大脑整合到宿主中枢神经系统中，表现出进行性神经元和神经胶质分化，在宿主脑的多个区域形成血管网络，且轴突连接不断增长[49]。目前，首例帕金森病患者移植iPSCs衍生多巴胺能神经元的试验已完成，且越来越多的iPSCs衍生细胞疗法正在进行临床试验测试[50]。首次基于iPSCs移植的ALS临床试验已于2019年开始[51]。

iPSCs为神经退行性疾病的细胞病因学提供了新的线索。iPSCs不仅具有自我更新、产量高、可扩增等优点，还具有产生多种不同神经元亚型的潜力[52]。iPSCs在疾病神经元衍生中具有明显作用，特别是可保留与年龄相关的疾病特征，这是神经退行性疾病模型建立的关键，但iPSCs仍有其局限性，其潜在机制仍有待证实。

3 神经干细胞

MSCs和免疫细胞可能通过旁路效应对ALS产生积极影响，但不能取代受损中枢神经细胞。神经干细胞(neural stem cells，NSCs)指神经系统中具有分化潜能的神经细胞(如神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞)，可为脑组织提供大量的细胞群。神经干细胞可能提供神经营养支持和取代胶质细胞或中间神经元，并可能通过分泌多种分子和生长因子发挥神经保护作用。欧洲和美国已经开展了利用人胚胎组织来源的神经干细胞在培养物中扩增的ALS相关试验[53-54]。有研究使用从人类8周胚胎脊髓中获得的特殊的人脊髓源性干细胞系(human spinal cord-derived stem cells，HSSCs)，将该细胞系置于无血清培养基中培养，并使用维持细胞增殖和避免细胞分化的成纤维细胞生长因子-2进行体外扩增[55]。临床前研究表明，HSSCs主要产生中间神经元，少数分化为星形胶质细胞[56]。此外，HSSCs能够分泌生长因子(包括脑源性神经营养因子和GDNF)，植入后，这些细胞可以表达谷氨酸转运体，可恢复受损运动神经元周围的功能性兴奋性氨基酸再摄取[57]。对ALS大鼠模型中HSSCs移植的研究显示，与接受死细胞移植对照组相比，HSSCs移植组的ALS发病时间延迟，存活时间延长，腹角运动神经元增加，对运动症状的积极影响短暂，但通过多次脊髓NSCs注射可以有效改善ALS动物模型的存活率[58]。

将胎儿皮质来源的NSCs移植至ALS模型SOD1G93A大鼠脊髓后，NSCs能够分化为神经保护性星形胶质细胞；若NSCs经转基因产生GDNF，对ALS模型SOD1G93A大鼠的运动神经元产生有益影响，不仅可延缓ALS模型SOD1G93A大鼠的发病、延长其存活时间、改善上运动神经元的健康状况，甚至可提高ALS模型SOD1G93A大鼠脊髓运动神经元的存活率[59]。ALS患者的萎缩脊髓可以耐受至少3 mL 细胞悬液以及最多20次不同脊髓节段的注射；且NSCs移植后随访2年，未发现肿瘤生长[60]。可见，NSCs移植未加速ALS的疾病进展，且ALS患者的NSCs移植相对安全可行。

目前基于临床前试验的NSCs研究极有限，小范围治疗试验的疗效评估很难，尤其是无随机安慰剂或观察对照组的试验。ALS的临床进展高度可变，目前导致这种变异的生物因素仍未知。因此，应谨慎应对个体间疾病病程差异的因果关系。现有NSCs移植治疗ALS的相关实验证据的疗效是否能够立即进行临床治疗试验仍有待商榷，在进一步的临床试验前，是否有必要提高NSCs移植的疗效亦有待研究。

4 胚胎干细胞

人类胚胎干细胞(human embryonic stem cells，hESCs)是一种源于人囊胚内细胞团，经体外分离、培养获得的原始多能干细胞[61]。Wyatt等[62]将hESCs衍生的人运动神经元祖细胞移植到ALS动物模型发现，移植后的人运动神经元祖细胞可使大量的内源性神经元存活，并产生神经营养作用。Izrael等[63]利用hESCs作为大量星形胶质细胞祖细胞的来源，进一步将星形胶质细胞祖细胞扩增并分化为可表达90%以上胶质纤维酸性蛋白的人类胚胎干细胞星形胶质细胞(human embryonic stem-astrocytes，hES-AS)，且移植后hESCs来源星形胶质细胞的功能特性已得到体外实验的证明。Izrael等[63]进一步对ALS动物模型(高拷贝数hSOD1G93A转基因小鼠和大鼠)的研究发现，hES-AS鞘内注射可明显延缓hSOD1G93A小鼠和大鼠ALS的发病，并有助于维持运动功能和延缓死亡；与正常星形胶质细胞相似，hESCs可通过多种机制保护运动神经元，如清除谷氨酸、分泌多种神经保护因子、中和活性氧类、促进神经生长；与空白载体溶液对照组相比，hESCs治疗组大鼠运动能力维持正常时间延长1个月以上；hESCs治疗组大鼠的中位生存期为216 d，而对照组大鼠的中位生存期为182 d，表明鞘内注射可延缓ALS发病和疾病进展，进而延长生存期。对免疫功能低下动物模型进行为期9个月的安全性研究显示，鞘内移植hES-AS是安全的[63]。上述研究均证实了鞘内注射hESCs治疗ALS的可行性、安全性和潜在疗效，但治疗ALS的临床试验仍然很少，hESCs相关研究所涉及的伦理问题还有待解决，且安全性也有待进一步探究；此外，hESCs的来源有限，且体外分化的条件极高，这些均限制了hESCs的应用和发展。

5 小 结

干细胞的临床前研究为人类试验奠定了基础，将干细胞分化为具有治疗潜力的细胞，揭示了通过改善疾病微环境毒性减缓神经退行性变的可能机制。目前，干细胞移植仍处于发展阶段，早期临床试验已证实了其安全性，干细胞的再生能力较强，但现有技术尚无法将其充分利用并用于治疗神经退行性疾病。迄今为止，干细胞移植研究成果是否足以支持进一步的临床治疗试验仍有待深入研究，在已经证明安全的干细胞源中，确定最有效的干细胞来源、剂量、给药部位及方法，对进一步提高干细胞移植治疗的功效具有重要意义。干细胞移植在治疗ALS和其他神经退行性疾病方面具有巨大的应用潜力，但以干细胞为基础的治疗仍需要大量研究。