尿源性干细胞在再生医学的应用及研究现状

宋强，张红，王钦，朱成

(1.成都医学院，成都 610500； 2.成都医学院第一附属医院急诊科，成都 610500)

干细胞具有发育全能性或多能性，可以诱导分化为多种细胞类型，目前许多学者对体干细胞、骨髓来源干细胞和脂肪来源干细胞进行了长期研究，并应用于组织工程和再生医学[1-2]。但间充质干细胞来源有限，目前临床广泛使用的供体来源细胞(如角质形成细胞、脂肪干细胞)样品可从血液、脐带血管、胚胎、皮肤和毛发中通过针插入刮擦、活检等有创操作获取，虽然这些细胞可以通过多种方案培养和分化，但样品分离复杂，细胞也需要较长时间扩增，因此寻找一种良好的种子细胞对组织工程及再生医学的发展具有重要意义。

Sutherland和Bain[3]从新生儿尿液中培养出具有有限增殖潜力的脱落细胞群。Zhang等[4]在培养无菌尿液时培育出3种不同形态的细胞，分别为完全分化的上皮细胞、分化的尿路上皮来源、肌肉来源、内皮来源的间质细胞和未分化的祖细胞，并将具有纺锤体外观的祖细胞分离，即为尿源性干细胞(urinary stem cells，USCs)。随后有学者证实尿液中可以培养出USCs，且膀胱肿瘤患者尿液中亦可分离培养出USCs[5]。由于USCs的肾脏皮质标志物的高表达来源于肾脏，若接受男性肾移植的女性患者中存在“Y染色体”，则表示USCs可能来源于肾脏[6-7]。USCs作为成体干细胞，可诱导分化为尿路上皮细胞、平滑肌细胞、成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、神经细胞、内皮细胞及心肌细胞，并可重编程为疾病特异性诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPSC)的原始细胞[8-11]。现就USCs在成体干细胞生物学特性及医学实验中的应用予以综述。

1 USCs生物学特性

USCs为短梭形“米粒样”外观，细胞生长曲线呈“S”形[4]。USCs在细胞增殖期间未出现变异及重组现象，但随着USCs传代代数的增加，部分表面标志物也会发生改变[6,12-13]。Lang等[14]发现，随着供体年龄的增长及尿液储存时间的延长，USCs的活力及增殖潜力可能降低。Bharadwaj等[6]进一步研究确定了USCs的生物学特性，USCs能够表达间充质干细胞标志物(CD29、CD44、CD54、CD73、CD90、CD105)、外周细胞标志物(CD146)、某些不稳定细胞的表达干细胞标志物(SOX2，Oct3/4、SSEA-4)，而不表达造血干细胞标志物CD11b、CD14、CD19、CD31、CD34、CD45、CD133等。此外，每个标志物的表达水平在成体干细胞的传代培养过程中可发生变化[15]。另有研究发现，USCs较其他广泛使用的干细胞(如骨髓干细胞、血液祖细胞、角质形成细胞祖细胞、脐带干细胞或脂肪来源干细胞)的扩展性更高[16-18]。

USCs的生长依赖于供体的年龄[14]。Gao等[19]通过研究供体年龄对USCs的影响发现，幼儿(非婴儿)尿液中分离的USCs具有更好的增殖和分化能力，揭示了“供体年龄越大，细胞衰老越多”的现象，表明青年人USCs更有活力，可以在短时间内获得更多USCs，从而用于基础研究和临床。间充质细胞移植后可产生轻微免疫反应，是理想的治疗细胞来源，但与同种异体血细胞混合时，USCs免疫反应更弱，说明USCs具有更好的免疫耐受性[20]。

2 USCs在医学实验研究中的应用

2.1USCs在泌尿生殖系统重建实验研究中的应用

USCs在泌尿生殖系统中主要应用于修复创伤、感染、肿瘤、畸形等原因引起的泌尿系统解剖结构异常和功能障碍。USCs在体外经过特殊培养基诱导，可转化为功能性尿路上皮细胞和平滑肌细胞，研究中将分化的USCs联合细菌纤维素支架移植入裸鼠体内时，可形成尿路上皮和平滑肌组织[13]。Lee等[21]采用USCs和聚己内酯表面修饰复合支架应用于膀胱重建，在纠正压力性尿失禁的细胞治疗策略的研究中发现，USCs可通过表达血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)促进肌肉和神经再生，且过表达VEGF的USCs可以提高移植细胞的存活率，促进肌源性分化，改善神经支配[22]。在神经损伤引起勃起功能障碍的研究中发现，海绵体内注射色素上皮衍生因子进行遗传修饰的USCs能够促进勃起功能恢复和维持损坏海绵体的结构[23]。对人工肾的研究发现，USCs也可以作为生物人工肾上皮和近端小管细胞的良好替代物，与生长因子结合并通过生物聚合物递送时，USCs可释放相似细胞因子(胰岛素样生长因子和VEGF)并增加血管形成，可见，USCs治疗肾脏疾病的应用前景广阔[22-23]。但由于肾脏是由26个异质组织组成的复杂器官，因此分化的USCs能否保持与肾脏相似的功能仍需广泛研究。

2.2USCs在皮肤修复重建实验研究中的应用 USCs联合聚己酸内酯/凝胶纳米纤维支架使用可以显著促进兔受损全层皮肤愈合。此外，USCs还可以通过释放细胞因子(VEGF、转化生长因子-β1)提升内皮细胞增殖、迁移和成血管能力[24]。Zhang等[25]研究发现，生物玻璃激活USCs的生长因子表达上调，且刺激USCs和受体细胞在伤口愈合中的旁分泌作用可促进内皮细胞的毛细血管样网络形成、促进基质蛋白的产生以及成纤维细胞向肌成纤维细胞分化，与未经任何处理的USCs相比，通过改善伤口部位的血管生成和胶原沉积，生物玻璃激活的USCs能够展现出更好的伤口修复能力。

2.3USCs在骨修复重建实验中的应用 成骨细胞移植物可用作骨再生的有效解决方案，可分化为大量成骨细胞的自体细胞来源对于人骨移植至关重要[26-27]。Zhang等[25]和Guan等[28]发现某些特定基因、试剂和细胞材料支架可促进USCs转化为成骨细胞，硅酸盐生物陶瓷颗粒/聚乳酸-羟基乙酸共聚物复合支架可以刺激USCs分化为成骨细胞，其作用机制可能是硅酸钙加快了USCs增殖，使与成骨有关的基因和蛋白的表达增加，提高了碱性磷酸酶的活性，进而促进了钙沉积，此外万古霉素(Wnt/β联蛋白信号抑制剂)能降低硅酸盐生物陶瓷颗粒提取物对USCs成骨分化的刺激，说明硅酸盐生物陶瓷颗粒提取物诱导的USCs的成骨分化可能涉及Wnt/β联蛋白蛋白信号通路[28]。银离子是临床上一种常用抗菌剂，Qin等[29]在研究纳米银颗粒对USCs细胞毒性和成骨分化的影响中发现，纳米银颗粒可以促进USCs成骨相关基因蛋白表达，当纳米银颗粒水平>4 mg/L时，呈浓度依赖性毒性，但纳米银颗粒水平合适时，可以促进USCs的成骨分化，但目前USCs联合纳米银颗粒的修复机制尚不明确。

2.4USCs在骨骼肌实验中的应用 Chen等[30]使用骨骼肌培养基诱导分化培养USCs的体外和裸鼠体内实验均显示，米粒样USCs在肌原性分化时被转分化为纺锤形骨骼肌细胞，且能够稳定表达骨骼肌相应标志物(如结蛋白、myf5、myod、肌球蛋白和肌间线蛋白)，并且可在针对MyoD染色的50%～60%细胞中观察到肌管样结构的形成。Liu等[9]研究发现使用含有放射性物质标记的生长因子的海藻酸盐微球注射到裸鼠中，USCs能表达出更多的肌源性和内皮细胞转录物和标志物。治疗压力性尿失禁时，尿道外括约肌由骨骼肌组成并受躯体神经系统控制，使用微珠负载的生长因子和USCs治疗时，USCs有效地产生了骨骼肌或内皮细胞系，并且通过微珠载体释放的生长因子促进骨骼肌和神经生长[9]。在杜氏肌营养不良症的药物筛选和功能性遗传研究中发现，天然USCs能表达全长肌营养不良蛋白转录物，经过肌原性转化后的细胞可能是研究肌营养不良蛋白基因的良好肌原性模型。此外，在肌营养不良症治疗中，USCs移植分化的肌肉细胞较目前的移植更有效。与iPSC和胚胎干细胞相比，USCs不仅能够存活，适度增殖，还可产生更多的分化细胞，因此USCs可能是骨骼肌再生细胞的潜在来源[6]。

2.5USCs在血管及神经再生实验中的应用 过表达VEGF的USCs能增加血管生成、细胞存活、细胞生长、提高移植细胞的存活率，对植入细胞向肌细胞转化以及植入后的神经支配具有促进作用[9,22]。Liu等[31]使用内皮分化培养基诱导USCs发现，诱导的USCs在体外和体内表达水平更高的内皮细胞特异性标志物(如CD31、血管性假血友病因子、一氧化氮合酶)，在裸鼠体内形成复杂的管状网络并呈现出类似血管的紧密连接、迁移和侵袭能力以及产生一氧化氮的能力。此外，如果通过小鼠中的水凝胶、胶原蛋白、藻酸盐微珠或三维生物膜递送，USCs可以改善体内血管形成和生长[32-34]。Guan等[12]将USCs接种到水凝胶支架并移植到大鼠脑皮质区，结果显示USCs能够在病变部位存活，并表达与神经表型相关蛋白质神经上皮干细胞蛋白、β-Ⅲ微管蛋白、胶质纤维酸性蛋白，通过慢病毒转染标记USCs，检测到受损部位存在由USCs分化的神经类似细胞，同时在大脑海马等部位也检测到分化的类神经细胞，证明USCs具有迁移能力。Kim等[35]使用含有层粘连蛋白和血小板衍生生长因子BB(platelet derived growth factor-BB，PDGF-BB)的神经元分化培养基培养USCs、层粘连蛋白和PDGF-BB分别促进USCs的神经元分化、层粘连蛋白和PDGF-BB的组合对USCs的神经元分化显示出协同效应。

2.6USCs在心脏疾病治疗中的应用 心力衰竭引起心肌损伤，导致心脏功能异常，经过介入等临床治疗，心力衰竭病死率和发病率仍然很高[36]。目前iPSC产生在心肌细胞样谱系中的研究已经取得许多进展，但人iPSC向功能性心肌细胞的分化仍未实现[37-38]。USCs可以通过细胞重编程分化为成熟功能性心肌细胞，并表达心脏特异性标志物(肌钙蛋白T，α-肌动蛋白等)，为了进一步研究USCs产生的心肌细胞是否具有电学特性，Jiang等[39]使用自发搏动细胞的微电极记录发现，USCs产生的心肌细胞与正常心肌细胞有类似的电学特性，可用于心脏修复。Cao等[40]从患有室间隔缺损心力衰竭患者的尿液样品中分离出了无整合的iPSC，并使用仙台病毒载体在RyR2基因中进行L2483R突变，通过小分子经典Wnt信号的调节，USCs快速且有效地分化为功能性心肌细胞，经过适当的分化和进一步筛选分子，它们可以进一步分化成相当数量的收缩同步的成熟心肌细胞，以修复心脏损伤。

2.7USCs在糖尿病治疗中的应用 糖尿病是增长最快的慢性疾病，是降低患者生活质量和生存率的重要原因，且伴有较多并发症，如糖尿病心肌病、肾病、神经病变、视网膜病变和膀胱病变[41]。世界卫生组织预测，2020年全球将有3.8亿糖尿病患者[30,42]。胰岛β细胞移植需要大量细胞(10 000个胰岛当量/kg)才能成功替代病变的胰岛功能[43]。因此，前体细胞的选择是实现移植所需细胞数量的基础。此外，用于再生疗法的细胞必须满足其他一般干细胞的特征，并以可重复的方式分化成多个谱系细胞。Dong等[44]通过尾静脉注射USCs治疗糖尿病的研究显示，USCs虽然没有使患者空腹血糖降至正常水平，但是对心肌、肾小球、逼尿肌的纤维化和凋亡有明显的抑制作用，防治糖尿病并发症。Jiang等[45]通过静脉注射USCs外泌体抑制胱天蛋白酶3过表达促进血管再生和肾小球内皮细胞增殖，减少了足细胞凋亡和肾小管上皮细胞凋亡，说明USCs外泌体可以预防糖尿病引起的肾脏并发症。

2.8USCs 在其他医学研究中的应用 Cai等[46]采用无融合的人尿诱导的iPSC产生牙齿样结构，检测发现iPSC分化成上皮片，这些薄片发育成类似于牙齿状结构的成釉细胞，具有与正常人牙齿相似的弹性模量和硬度等物理性质。人肺泡Ⅱ型上皮细胞(alveolar type Ⅱ epithelial cells，AT-Ⅱ)仅占肺泡内衬物的5%，对肺泡修复和维持体内平衡至关重要。Wang等[47]采用四阶段培养法诱导USCs分化为AT-Ⅱ细胞，这些细胞与正常人AT-Ⅱ细胞的表型特性相似(如伸展和上皮样形态以及AT-Ⅱ细胞的特异性表达标志物)，在肺病细胞治疗和再生医学有巨大的应用前景。软骨缺陷会限制关节活动，造成疼痛、生活质量下降，Chen等[48]发现，透明质酸和USCs混合物可以刺激软骨缺陷兔膝关节中更多新软骨的形成，可作为未来治疗软骨相关缺陷的潜在细胞来源。

3 小 结

由于USCs具有易于分离和培养、非侵入性、高增殖效率和稳定的核型、无致瘤性等优点被应用于再生医学领域。尽管USCs的研究与其他自体干细胞存在差距，但有报道表明，USCs可作为组织工程中种子细胞的新来源[49]。USCs多向分化潜能还可用于组织工程修复重建、疾病治疗、药物毒性筛选等，但USCs用于临床治疗仍需要更全面的临床前分析和标准化应用程序。