9p21 位点多态性与脑卒中相关性的研究进展

钟成清，杨丽立，舒鑫，王普，余能伟

(1.成都市第七人民医院神经内科，成都610041;2.四川省医学科学院 四川省人民医院神经内科，成都610072;3.绵阳市第三人民医院神经内科，四川 绵阳621000;4.崇州市人民医院神经内科，四川 崇州611230)

脑卒中作为一组以局灶性神经功能缺失为特征的高致死、高致残性急性脑血管疾病，已成为目前严重威胁人类健康的主要疾病，分为出血性和缺血性。目前公认的脑卒中危险因素包括高血压、糖尿病、高同型半胱氨酸血症、血脂异常、吸烟、心房颤动、肥胖等，只有吸烟为可完全控制的危险因素，其他危险因素可通过药物、运动和饮食习惯调整等部分改善。部分脑卒中可能与遗传因素导致的个体差异有关。随着遗传学的飞速发展，脑卒中的遗传学研究逐渐成为近年来的研究热点。研究显示，遗传和环境因素在脑卒中的发生、发展中有着重要影响［1］。以单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)为基础的全基因组关联研究(genome wide association study，GWAS)是当今复杂性疾病强有力的研究手段，已经发现大量易感位点和易感基因，其中染色体9p21.3 基因座已被证实存在某些疾病［如心血管疾病(cardiovascular disease，CVD)［2］、缺血性脑卒中(ischemic stroke，IS)［3］、主动脉瘤［4］、颅内动脉瘤［5］、原发性开角性青光眼［6］、2 型糖尿病［7］、胶质瘤［8］、肿瘤易感性［9］］的易感位点，提示染色体9p21 中存在重要的不稳定的基因座。现就9p21 位点多态性与脑卒中相关性的研究进展予以综述。

1 9p21 位点多态性常用研究方法

遗传多态性通常是指同一生物群体中，两种或以上的变异类型或基因型并存的现象，同时，这种变异型的数量保持在相对稳定的比例［10］。SNP 主要是指在基因组水平上单个核苷酸发生变异所引起的DNA 序列多态性［11］，其具有分布均匀、数量大、稳定性高、自动化分析便捷等特点［12］，是重要的基因遗传标记，能准确识别有关区域的易感基因。

近年来，以SNPs 为基础的GWAS 已成为研究复杂性疾病易感位点和基因的主要检测方法。GWAS的基本策略是用基因芯片在全基因组范围内同时对数十万乃至上百万个SNP 进行检测，通过病例对照关联分析，在不同的群体及大样本中进行多阶段重复验证并整合结果，从而筛选出与疾病关联的常见变异。GWAS 已成功发现多个与人类常见疾病有很强关联性的SNPs，据国际人类基因组研究所和欧洲生物信息研究所统计，截至2015 年6 月，共有2 000 多篇GWAS 研究被收录，累计发现15 000 个SNPs 位点与约8 000 相关性状或疾病相关［13-15］，但被发现的相关位点的作用效应很微弱，不能完全解释这些疾病的遗传风险，很难直接定位致病变异，尤其涉及家系和个体中的稀有或低频变异时，GWAS 很难发现［16］。随着科学技术的发展，以外显子测序技术为主的高通量测序得到了蓬勃的发展，它能发现与疾病相关的低频变异、罕见变异和新的基因，正好与GWAS 发现常见变异形成互补［17］。有研究发现，罕见变异在复杂疾病遗传作用的生物学功能可能更大［18］。高通量测序技术的不断创新和发展，为进一步探究多基因复杂疾病打开了新的思路，为深入了解人类疾病发生的遗传机制提供了重要线索和科学依据。

2 9p21 概述

9p21 区域DNA 序列全长约为175 kb，具有高度连锁不平衡性，主要有甲硫腺苷磷酸化酶(methylthioadenodine phosphorylase，MTAP)、细胞周期蛋白依赖激酶抑制因子(cyclin dependent kinase inhibitive factor，CDKN)2A 和CDKN2B、ANRIL(antisense non-coding RNA)等基因［19］。MTAP 在甲硫氨酸和嘌呤的合成补救中起关键酶作用，并参与多胺代谢途径，生成DNA、ATP 和甲硫氨酸，最终在细胞的DNA、能量、蛋白质合成中起重要作用，参与细胞的新陈代谢，另外，MTAP 的缺失与肿瘤形成相关［20］。也有学者研究发现，在中国汉族人群中MTAP 基因中的SNP 位点与冠心病、IS 的患病相关［21］。CDKN2A 编码蛋白质p16INK4a(p16 inhibitor of cyclin-dependent kinase 4a)和p14ARF(p14 alternative reading frame)，CDKN2B编码蛋白质p15INK4b，这些蛋白质均参与细胞周期调控、老化、衰老、凋亡，并与动脉粥样硬化形成有密切关系，当然CDKN2A 和CDKN2B 也是抑癌基因［22］。ANRIL 是INK4 位点上一段长约126.3 kb 的反义非编码RNA，与其他3 个主要基因有部分重叠，与CDKN2B转录的方向相反，有研究还表明，ANRIL 可调节邻近基因CDKN2A/2B 表达，也可能通过某种机制干预远距离靶基因的表达，是目前各国科学家研究9p21 的一个重要位点［23］。ANRIL 被认为是原癌基因，参与胃癌、肺癌、肝癌、食管鳞状细胞癌的形成，ANRIL 沉默可以抑制癌细胞增殖、迁移和侵袭，在各种肿瘤中ANRIL 表达升高，可以作为某些肿瘤的诊断和预后标志物;另外，ANRIL 已经成为CVD 的重要遗传易感基因，该位点的众多SNP 与CVD 发病风险直接相关［24-25］。

3 IS 与9p21

脑卒中是目前我国居民疾病死亡的第一大原因［26］。尽管目前加强了卒中的预防，提高了诊断水平，治疗措施也不断改进，但脑卒中仍表现为高发病率、高致残率和高病死率，而且世界卫生组织预计，到2025 年脑卒中发病率会增加27%，对人类社会的健康造成巨大危害，给患者和社会带来严重的经济负担［27-28］。脑卒中分为IS 和出血性脑卒中，IS 约占全部脑卒中发病率的80%［29］，是受遗传、环境和血管危险因素相互作用而引起的一种多因子复杂疾病［30］，大约一半的发病可以用传统危险因素解释，如缺血性心脏病、高血压、糖尿病、血脂异常、吸烟及心房颤动等［31］。越来越多的研究表明，遗传因素在IS 发展中起着非常重要的作用［32］，但国内外学者研究9p21 与IS 是否相关联，得出的结论却不一致。

Matarin 等［33］在249 例IS 白种患者及268 例对照中用GWAS 检测了超过40 万个特殊SNPs，结果没有一个位点与卒中风险密切相关，但却首次发现了9p21 染色体上的CDKN2A 与IS 存在某种微弱关联。后来大多数研究证实了9p21 确实可增加IS 的发病风险［34-35］，但另有研究发现，9p21 与IS 之间不存在这种关联性［36-39］;多项荟萃分析也显示，9p21中相关位点是IS 的危险因素，尤其与大动脉粥样硬化型(large artery atherosclerosis，LAA)卒中存在显著的关联［40-42］。Lu 等［43］在528 例非心源性IS 患者(375 例合并颈动脉斑块，153 无颈动脉斑块)、258 名健康对照者中对9p21 区域中的6 个SNPs 进行了检测，结果发现，rs2383206、rs4977574 的G 等位基因是IS 的风险等位基因，且中年人群中的无颈动脉斑块组携带该基因人数显著多于正常对照组;含有GG 纯合子的个体比含AG/AA 基因型具有显著增加IS 风险效应;另外，该研究还发现，65 岁以上IS 患者rs2383206、rs4977574 的G 等位基因与颈动脉斑块发生风险相关。Lövkvist 等［44］也在3 986 例IS 患者和2 459 名健康对照者中证实了9p21 上的SNP rs4977574 与IS 相关。Bi 等［45］指出染色体9p21 是IS 的一个易感基因，其变异产生的影响可能会随着年龄的变化而发生改变;该研究第一次证明了rs10757278 GG 基因型、rs1537378-C 等位基因、rs1333047TT 基因型与中国汉族人群IS 相关联;同时还发现，在IS 中rs10757278-GG 携带者血浆总胆固醇、三酰甘油和低密度脂蛋白水平显著增加，在纳入对照组后差异仍然有统计学意义(P ＜0.05)，从而推测rs10757278 变异可能对血脂水平有不同程度的影响，同时有rs10757278-G等位基因变异和血脂异常的人可能患IS 的易感性更高，基因型对于血脂水平的影响一定程度上会干预IS 的进程。最近的一篇关于rs10757274 的荟萃分析(纳入10 个研究，6 746 例病例及12 577 例对照)显示，按种族分组的亚组分析中rs10757274G 等位基因携带者发生IS 的风险增加(包含亚洲人和高加索人);进一步对rs10757274 与LAS 进行相关性分析表明，等位基因或GG 基因型增加了亚洲人LAS 的发病风险(等位基因模型:OR =1.18，95%CI 1.06 ～1.1，P=0.002;隐性模型:OR =1.33，95%CI 1.12 ～1.57，P=0.001)［46］。2015 年，Carty 等［47］在《Stroke》上发文，第一次针对GWAS 研究中的14 746 例非洲裔美国人(含1 365 例IS、1 592 例混合型卒中)进行了荟萃分析，对达到P ＜10-6的相关基因位点在欧洲血统人群缺血性脑卒中遗传研究联盟(METASTROKE)上进一步验证，结果表明，在非洲裔美国人身上发现了一个新的与血脂水平和高血压有关的基因变异，即基因15q21.3 位点上rs4471613发生了变异，该变异与所有的卒中相关(P =3.9 ×10-8)，在欧洲人群中已证实与IS 相关的易感位点可能也与之相关。2015 年，美国国立神经病学与卒中研究所和国际卒中遗传学联合会分2 个阶段做了一个大规模GWAS 识别卒中及其亚型易感基因的研究，结果在1p13.2 位点的TSPAN2 附近发现了一个新的与LAA 相关的基因座(G 等位基因位于rs12122341);同时研究结果也支持之前被多次报道的4 个位点(包括PITX2、ZFHX3、HDAC9、12q24)与IS 密切相关，但以前研究发现的相关易感基因NINJ2、9p21.3 均未被证实［48］。2015 年，另一篇发表在《Stroke》的文章试图在LAA、心源性脑栓塞(cardio-embolism，CE)和小血管闭塞(small vessel occlusion，SVO)3 种IS 亚型中寻找共同的易感基因，该研究共纳入12 389 例IS 患者(包括2 167 例LAA、2 405 例CE 和1 854 例SVO)和62 004 例对照组，结果发现，在LAA 与SVO 型之间有很高的遗传相关性，LAA 与CE、SVO 与CE 只有在混合线性模型下才有微弱的关联;随后又对LAA 和SVO 进行了荟萃分析，发现6q25.2 上OPRM1 的rs17084671(P=1 ×10-7)与之有很强的关联，可能是LAA、SVO 的共享遗传基因［49］。Söderholm 等［50］对瑞典南部人群(IS 组2 385 例，对照组6 077 例)进行了外显子测序，结果没发现与之相关的易感位点和易感区域。其他证实过与IS 相关的易感基因有APOE(E2/E3/E4)基因［51］、10q25 上HABP2 附近rs11196288［52］、12p13 上rs12425791［53］、9q34.2 上ABO 和7p21.1上HDAC9(与LAA 卒中相关)、PITX2 和ZFHX3 基因(与CE 型卒中相关)［54］以及血管紧张素转换酶基因(与非CE 型卒中相关)等［55］。针对以上众多学者关于9p21 与IS 的关联性研究结果不一致的情况，推测脑卒中是一种异质性疾病，据TOAST(trial of org 10172 in acute stroke treatment)病因学分型，分为LAA、CE、SVO、其他病因确定的卒中、不明原因型5 个类型，各个亚型分别有独特的病因、危险因素、遗传特征，甚至亚型之间也可能有共同的遗传成分;不同地区、种族、人群之间也可能有不同的基因分布特点，存在表达差异;一些研究样本量偏小，有不同情况的选择偏倚，忽略了其他因素对IS 的影响，造成了假阳性的结果。

4 动脉瘤与9p21

2008 年，随着9p21 上10757278-G 与冠心病、rs10811661-T 与2 型糖尿病相关联的报道出现，Helgadottir 等［4］试图去探寻两基因位点与动脉瘤的关系，结果第一次在欧洲人群中证实了9p21 上的rs10757278-G 与腹主动脉瘤和颅内动脉瘤相关。同年，Bilguvar 等［56］在涉及芬兰、荷兰、日本人群的2 100 例颅内动脉瘤和8 000 例对照分析中，不仅证实了9p21 上的CDKN2A 与动脉瘤有很强的相关性，还新发现了染色体2q、8q 也与之相关。Foroud 等［57］首先在白色人种2 617 例颅内动脉瘤和2 548 例对照组中进行基因分析，同时进一步荟萃分析，结果又新发现了一个与颅内动脉瘤相关的位点，即第7 号染色体上HDAC9 的rs10230207，同时也证实了9p21 上CDKN2BAS 的rs10733376 与颅内动脉瘤的相关性。Loinard 等［58］在小鼠上剔除9p21 非编码区上心血管风险区间，结果促进了动脉瘤的生长，从而证明了染色体9p21 与动脉瘤易感性有直接关系。Kurki等［59］通过大样本、多中心病例对照分析研究发现，9p21.3、2q23.3、2q33.1、5q31.1 和6q24.2 与囊状动脉瘤相关。Abrantes 等［60］研究发现，rs4667622(UBR3 和MYO3B 之间)、rs6599001(3p22.2 上SCN11A和WDR48 之间)、rs3932338(5p14.2 上PRDM9 下游)、rs10943471(HTR1B 上游)、rs1333040(9p21)与颅内动脉瘤相关，而且新发现的前4 个位点与颅内动脉瘤的关联性比rs1333040 更强。van't Hof 等［61］在3 个GWAS 关于动脉瘤的队列研究中(颅内动脉瘤1 516 例，对照组4 305 例;腹主动脉瘤818 例，对照组3 004 例;胸主动脉瘤760 例，对照组2 212 例)试图寻找共同致病基因，结果在3 种动脉瘤之间没有发现一个与之显著相关的共同致病基因，只是发现18q11 附近的RBBP8 是颅内动脉瘤和腹主动脉瘤的风险基因，15q21 附近的FBN1 是主动脉瘤和腹主动脉瘤的风险基因。我国也有学者去探究动脉瘤与染色体9p21 之间的关系，张利通［62］在天津地区的119 例颅内动脉瘤患者及257 例对照者中分析了22 个基因区域的28 个SNP 位点，结果只发现了糖尿病相关基因SLC2A9 上rs7660895 和TOX 基因上rs11777927 是颅内动脉瘤的易感基因。Wei 等［63］在155 例腹主动脉瘤和310 例对照组中发现，9p21.3 上的rs10757278-G、rs1333049-C 显著增加了腹主动脉瘤的患病风险。Nakaoka 等［64］通过研究发现，9p21 对颅内不同位置的动脉瘤影响不一样(后交通动脉部强于前交通动脉)，随后又在动脉瘤未破裂组和破裂组之间比较基因的表达谱，探究诱发动脉瘤破裂的生物机制，结果发现，S100A8、S100A9、S100A12表达水平的下调会导致动脉瘤血管壁变薄，抗炎因子Krüppel 样转录因子(krüppel-like transcription factor，KLF)2、KLF12、KLF15 和CDKN2A 的下调也与动脉瘤相关。9p21 引起动脉瘤的具体机制尚不清楚，需要广大学者更深入的研究，血管壁结构改变可能是其中之一。

5 小 结

9p21 区域在多种复杂疾病的病理生理机制中可能发挥重要的作用，9p21 区域上存在多个疾病易感位点，这种现象集中在疾病共同的机制上，尤其是血管性疾病，揭示了该区域与血管相关性疾病的密切联系。全面准确地查找脑卒中的危险因素，做好针对性的预防措施，将显著减轻脑卒中导致的严重社会及家庭负担。通过基因检测或预测模型将高危人群从一般人群中精确筛选出来将对疾病的防治起到积极作用，也为个体化治疗提供基因证据和靶点。为此，有必要开展广泛人群的基因筛查和健康人群对照，建立流行病数据库有助于更全面地收集遗传信息，减少卒中的发生。