循环肿瘤DNA检测应用于非小细胞肺癌的研究进展

刘万立，洪琼川

(1.遵义医科大学珠海校区，广东 珠海 519000； 2.深圳市龙岗中心医院心胸外科，广东 深圳 518116)

肺癌在我国癌症中的发病率和病死率均居首位，每年肺癌发病人数约为78.1万，死亡人数约62.6万[1]。肺癌的病理分型中非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)约占总数的85%。随着肺癌早期筛查技术的普及和治疗方式的发展，1990—2015年男性肺癌患者的病死率下降45%，2002—2015年女性肺癌患者的病死率下降19%[2]。对于肺癌早期、癌细胞未转移的患者，外科手术切除为最佳治疗方式。患者术后5年生存率与肺癌的分期有关，ⅠA期肺癌患者的5年生存率为90%，Ⅱ期为60%[3-4]。而对于肺癌分期较差的患者，术后辅助化疗、靶向治疗、免疫治疗等对提高患者生存率必不可少[5-6]。可见，早期筛查、诊断与治疗对于提高肺癌患者的生存率、延长患者的生存年限至关重要。因此，寻找一种能够用于指导肺癌患者全程治疗的生物标志物非常重要。液体活检技术是目前研究的热点，其是对循环血液中的循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)、循环肿瘤细胞、外泌体和肿瘤相关血小板进行检测的一种方法[7]。液体活检在NSCLC中的应用研究以ctDNA研究较为广泛，现就ctDNA在NSCLC中的应用研究进展予以综述。

1 ctDNA的检测

ctDNA是一种由肿瘤原发灶(继发灶)释放入血的肿瘤DNA，其以单链DNA、双链DNA、DNA蛋白质复合物等形式广泛存在于血液、脑脊液等体液中[8]。目前认为，ctDNA主要来自血液中坏死、凋亡的肿瘤细胞和肿瘤细胞分泌的外排体[9-10]。研究表明，肿瘤患者体内血浆游离DNA的平均含量约是健康人体的6倍，血液中ctDNA具有含量低、半衰期短等特点，且其绝对含量会随肿瘤负荷和治疗反应发生变化，所以检测ctDNA的技术需要有较高的敏感性和特异性[11]。既往研究报道了许多不同的检测方法，如数字聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)、实时荧光定量PCR及二代测序(next generation sequencing，NGS)等通过定性、定量检测循环DNA的基因突变以确定ctDNA是否存在，这些检测方法均存在各自的优缺点[12]。如上海胸科医院将NGS用于早期和晚期NSCLC患者的检测时发现，使用NGS方法检测血浆中ctDNA基因突变与术后病理组织基因突变检测的阳性符合率早期为44.4%，晚期为71.4%[13]。Newman等[14]报道了一种癌症个体化深度测序分析方法，该方法在检测ctDNA基因突变的敏感性和特异性方面都优于之前的检测方法。在此基础上，Newman等[15]又提出一种集成数字错误抑制的方法，该方法用于NSCLC患者表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)酪氨酸激酶突变检测的灵敏度为92%，特异度为99.99%。随着液体活检技术的发展，ctDNA检测技术的敏感性和特异性不断提高，已经越来越接近临床应用水平。

2 ctDNA临床应用

2.1用于肺癌的早期筛查和早期诊断 肺癌早期筛查、早期诊断的方式多种多样，如低剂量CT、血清肿瘤标志物检测等。低剂量CT对具有高危风险患者的筛查具有较高的敏感性，但同时也存在较高的假阳性率[16]。Patz等[17]研究发现，低剂量CT用于肺癌早期筛查的假阳性率为96.4%，总体上可能存在18.5%的过度诊断。目前血清肿瘤标志物有癌胚抗原、神经元特异性烯醇化酶、细胞角蛋白19片段、糖类抗原、鳞状上皮细胞癌抗原等，但上述血清肿瘤标志物对肺癌进行诊断时的敏感性和特异性均不能满足临床需求，因此需要一种特有的、侵入性较低的生物标志物取代或作为一种补充方式用于肺癌的早期筛查、早期诊断[18]。而ctDNA在肺癌筛查和早期诊断方面具有较大的潜力。Sozzi等[19]运用实时荧光定量PCR检测出肺癌患者血浆DNA的人端粒酶逆转录酶基因是正常人的8倍，提示高表达人端粒酶逆转录酶基因人群的患癌风险更大。Gautschi等[20]的研究表明，血浆DNA水平与肿瘤的分期有关。以上研究表明，使用PCR分析技术对ctDNA进行检测可作为识别肺癌高风险人群的潜在工具。然而后续研究发现，单独使用血浆ctDNA水平的基线评估并没有提高肺癌筛查的准确性，但血浆ctDNA量化可能起到补充筛查和诊断测试的作用[21-22]。随着肿瘤发病机制研究和分子检测技术的快速发展，人们发现除了对ctDNA进行定量分析外，对ctDNA上特定的异常基因进行分析可能会发展成为更有前途的肺癌早期筛查与诊断的无创手段。Chen等[23]通过测定58例分期分别为IA、IB和IIA的早期NSCLC患者的肿瘤组织DNA和血浆ctDNA的EGFR基因、鼠类肉瘤病毒基因(kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog，KRAS)、磷脂酰肌醇-3-激酶催化亚基α(phosphatidylinositol-4，5-bisphosphate 3-kinasecatalytic subunit alpha，PIK3CA)、肿瘤蛋白53基因(tumor protein 53，TP53)等肺癌常见突变基因，发现肿瘤组织DNA与血浆ctDNA突变一致率为50.4%，灵敏度为53.8%，特异度为47.3%，血浆阳性预测值为53.2%，该研究证实了检测人群中血浆ctDNA突变用于肺癌早期筛查、诊断的可行性。但另一针对123例健康人群血浆游离DNA检测的研究发现，TP53突变率高达11.4%，这对该方法的特异性提出了异议[24]。研究发现，肿瘤细胞在抑癌基因、修复基因等启动子区域的甲基化状态升高，且抑制了相应抑癌基因的表达，肿瘤细胞的高甲基化多发生于启动子区域的CpG岛，而正常细胞启动子区的CpG岛多处于非甲基化状态[25]。Baglietto等[26]抽取吸烟患者的外周血检测5个基因(AHRR、F2RL3、2q37.1、6p21.33、12q14.1)确定了6个CpGs的甲基化，并发现通过检测这6个CpGs的甲基化有助于提高对吸烟患者罹患肺癌的风险预测。一项研究对 48例Ⅰ期NSCLC患者的ctDNA样本进行了DNA甲基化分析，研究覆盖了14 500个基因的启动子，结果发现有379个基因中的496个CpGs呈高甲基化状态和335个基因中的373个CpGs呈低甲基化状态[27]。这些研究均证实了检测血液中循环DNA的甲基化可用于肺癌的早期筛查、早期诊断。目前有学者对肺癌患者血浆中单个或一组抑癌基因的甲基化作为潜在肺癌早期诊断的生物标志物进行了评估，主要包括O-6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶、周期素依赖性蛋白激酶抑制物2A、Ras相关区域家族1A、死亡相关蛋白激酶、视黄酸受体β和人矮小同源盒基因等[28-29]。目前对于ctDNA的定量分析和特定基因的突变分析，其敏感性和特异性尚未达到临床应用水平，此外关于ctDNA的检测与其他筛查手段(如低剂量CT、血清肿瘤标志物等)相结合是否能提高诊断敏感性、特异性尚未见报道，而关于ctDNA甲基化检测能否成为NSCLC早期筛查和诊断的方法尚需大样本临床研究结果证实。

2.2指导NSCLC患者治疗 肺癌的治疗从单纯的手术治疗、化疗发展到手术治疗、化疗、靶向治疗和免疫治疗相结合的综合治疗，显著提高了肺癌患者5年生存率。化疗是晚期肺癌最重要的治疗手段，但其总体有效率仅为25%～35%，肺癌患者的中位生存期为8～10个月[30]。随着21世纪精准医疗计划的提出，精准医疗迅速成为医药领域的热门话题[31]。而基因检测分型在促进精准医疗的发展过程中起重要作用，在此背景下，肺癌靶向治疗的快速发展为肺癌患者带来了新的曙光。然而，靶向治疗的前提条件是对肿瘤进行基因分型检测，以寻找药物靶点。

目前，临床实践中大多使用组织活检的方法获得肿瘤DNA，实现基因分型，然而组织活检只能获得局部和静态的肿瘤信息，且由于肿瘤异质性和肿瘤的不断演变而无法反映实时的肿瘤基因分型，但是通过ctDNA进行基因检测分析不仅能够解决这些问题，还能解决病理组织无法取得或所取组织太少而不能进行基因检测分型的问题，此外ctDNA的半衰期小于2 h，能实时反映肺癌在治疗过程中体内肿瘤的负荷情况[32]。Sim等[33]通过对晚期NSCLC或一线酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor，TKI)耐药患者的总共50份血浆样品的7个基因组(BRAF、EGFR、ERBB2、KRAS、NRAS、PIK3CA、PTEN)进行深度测序分析，结果发现有88%的患者至少发现了一个基因突变位点，50%的患者发现了至少一个可行的靶向治疗位点。该研究结果与Thress等[34]的研究结果相似，表明对NSCLC患者血液中的ctDNA进行测序寻找药物治疗靶点的可能性。与手术或穿刺获取病理分型相比，通过ctDNA测序获取药物治疗靶点具有简单、无创的优点，特别适用于晚期NSCLC患者。随着液体活检技术的发展，ctDNA检测已逐步应用于临床。2016年5月，美国食品药品管理局首次批准了针对NSCLC患者此类液体活检检测试剂盒(CobasVR EGFR Mutation Test v2)的使用，该试剂盒可用作厄洛替尼的伴随诊断试剂盒[35]；2016年12月，首个基于NGS检测技术的伴随诊断试剂盒获批上市[36]。由此可见，对血浆ctDNA基因检测分析除了能指导NSCLC患者的靶向治疗，也将在一定程度上促进精准医疗的发展。然而，ctDNA测序能否在临床应用上取代组织病理分型尚需大量研究证实。

2.3指导耐药患者药物的选择 随着NSCLC患者靶向治疗的兴起，靶向药物耐药问题随之出现。目前关于耐药的研究多集中于NSCLC热点靶向药物(以EGFR、间变性淋巴瘤激酶抑制剂为主)，约50%检测出EGFR突变的NSCLC患者在使用第一代和第二代EGFR-TKI治疗后9～13 个月内出现耐药性[37-38]。EGFR-TKI获得性耐药患者60%由于第20号外显子发生错义突变(T790M突变)，EGFR T790M被确定为获得性EGFR-TKI耐药的最常见机制，其他机制还包括间质上皮转化因子(mesenchymal epithelial transition factor，MET)扩增、肝细胞生长因子受体(hepatic growth factor receptor，HGFR)扩增等[38-39]。接受第一代和第二代EGFR靶点药物治疗过程中出现T790M突变的患者，可以改用第三代Osimertinib治疗。可见，在靶向药物治疗过程中需要对肿瘤进行基因检测分析以发现耐药突变位点，从而调整治疗方案，这就要求NSCLC患者在进行靶向治疗过程中需连续获取病理组织进行基因检测分型，以寻找明确获得性耐药突变位点。手术活检、细针穿刺活检是目前常用的获取病理组织的方式，但这些方法存在风险大、重复性差、取材过少不能检测等缺点。而抽取患者外周血进行ctDNA的基因检测分析用于耐药的监控和研究具有独特优势，尤其对不易被活检或手术切除肿瘤的肺癌患者有重要价值。Zheng等[40]连续监测117例EGFR-TKI获得性耐药患者的血浆ctDNA，发现47%的患者出现EGFR T790M阳性。Thress等[41]对使用奥希替尼治疗耐药的15例患者的血浆ctDNA进行基因检测分析发现，使用奥希替尼治疗前所有患者均存在EGFR T790M突变，使用奥希替尼耐药后发现，6例患者获得了C797S突变，4例失去了T790M突变。以上研究均表明对于某种药物耐药的患者，对其血液中的ctDNA进行检测可能会找到新的药物靶点，从而指导患者用药，且有益于对耐药机制的研究。

2.4术后疗效的评估 对于早期NSCLC患者，外科手术切除是最佳手术治疗方式。手术效果评估多以切缘的术中冰冻结果进行判断，但是术后患者仍存在复发风险，Ⅰ期患者术后5 年复发率为20%，Ⅲ期患者为50%[42]。然而，目前临床对于手术的效果评估以及术后是否需要采取辅助化疗、靶向治疗等没有明确的判断指标。一项研究通过检测不同分期的NSCLC患者术前术后血浆ctDNA的EGFR、KRAS、TP53、BRAF、PIK3CA基因突变频率发现，91.7%在术前ctDNA检测中出现突变的Ⅰa、Ⅰb期患者的突变频率在2 d内发生了下降，其平均突变频率从术前的8.88%下降为术后的0.28%，其原因是肿瘤的切除而导致ctDNA的释放减少；此研究还提出，未来有希望通过检测患者术前术后血浆ctDNA 的突变频率来判断手术疗效[43]。Hu等[44]对168例肺癌患者术前、术后ctDNA进行定量分析和基因突变分析发现，术后仍能检测到ctDNA基因突变或术后ctDNA水平较高的患者具有更高的复发率。该研究表明，在术后进行ctDNA检测分析有希望用于手术疗效的评估以及为术后患者是否需要行辅助治疗提供参考。

另外，手术切除肿瘤后的微小残留病灶(minimal residual disease，MRD)作为ctDNA的来源之一逐渐引起了人们的注意，有报道称，1例行手术治疗和术后化疗复发的患者，在放射性标准诊断复发前20个月就在其ctDNA中检测到最小等位基因频率为 0.04%[45]。随着ctDNA检测技术的发展，更多的低频突变基因能够被用于检测判定患者体内的MRD。有证据表明，ctDNA可在临床疾病复发之前监测到MRD，如ctDNA在乳腺癌治疗后的MRD监测，但这种方法在改善患者预后方面的价值需前瞻性介入试验加以证明[39，46]。以上研究均证明了基于目前ctDNA检测技术的发展，有望在NSCLC患者术后通过对ctDNA进行定量分析或基因突变分析以判断手术疗效并评估是否需要术后辅助治疗，以及术后定期评估血液中的ctDNA以判断是否存在分子残留肿瘤，以达到早期干预并提高生存率的目的。

2.5预后与复发的评估 目前，临床尚未有明确的指标用于评估NSCLC患者的预后和复发，术后多使用影像学检查随访，然而影像学检查具有明显的滞后性和价格昂贵等缺点。随着液体活检的兴起，有研究报道了ctDNA与NSCLC患者预后和复发的相关性，如Sozzi等[21]研究证明，肺癌术后血液中ctDNA 水平较高患者的5年生存率明显低于血液中循环ctDNA水平较低的患者。

Chaudhuri等[45]研究表明，肺癌治疗后抽取的血液样本中能检测到ctDNA的患者具有较高的术后复发率，与放射性检查相比，ctDNA检测在评估术后复发方面具有较高的敏感性，同时需要进一步评估是否存在过度治疗。一项大样本的前瞻性研究也证明了术后30 d患者ctDNA中KRAS和EGFR突变的水平也可以作为评估预后的参考值[44]。也有研究表明，在靶向治疗过程中，通过检测血浆ctDNA而出现获得性耐药基因突变的患者，其中位生存期明显短于突变阴性的患者[47]。随着研究的深入，ctDNA的检测有望在NSCLC患者的预后和复发中发挥重要作用。

3 小 结

基于液体活检技术的快速发展，ctDNA作为无创生物标志物正逐步应用于临床。ctDNA的检测具有无创、可重复等优点，可在NSCLC患者的早期诊断、指导治疗和评估预后等方面发挥出巨大的潜在临床应用价值。随着“精准医疗”方法的提出，将ctDNA作为基因水平的标志物是未来重要发展方向。但是存在ctDNA的检测无统一的定量标准、不同的检测方法差异较大等问题，且目前尚无大样本临床研究数据证明，ctDNA可以直接应用于临床。将来随着肿瘤发病机制的深入研究和分子检测技术的发展，ctDNA检测有望真正运用于肺癌的临床诊疗。