蛋白质中氨基酸外消旋化修饰的非特定位点分析方法研究进展

王佳凤，王生伟，李博**，狄斌

（1. 中国药科大学药物分析系，江苏 南京 210009；2. 中国药科大学蛋白质化学与结构生物学重点实验室，江苏 南京 210009；3. 南京市胸科医院急诊科，江苏 南京210029）

1 外消旋化修饰简述

蛋白质是一种手性分子，其结构由其氨基酸组成和结构所决定。除甘氨酸外，天然存在的氨基酸都具有2 种手性形式，因而可能形成具有相同氨基酸序列的非对映异构体蛋白。最初，生物学上认为生物体只利用L-氨基酸来合成蛋白质[1]。20 世纪40 年代起，在微生物体内发现含D-氨基酸多肽[2]，其中一些多肽是通过硫酯中间体[3]在多酶复合物上逐步组装的。在20 世纪80 年代， Kreil 等[4]从南美树蛙的皮肤分泌物中分离出了一种具有生物活性的D-氨基酸多肽。

蛋白质的氨基酸外消旋化（amino acid racemization，AAR）指蛋白质中至少1 个氨基酸残基从L-氨基酸转变为D-氨基酸，这是一种蛋白质翻译后修饰（post-translational modification，PTM）类型，通常用D-/L-氨基酸含量比值表示修饰程度[5]。AAR 可能会引起蛋白质分子内氢键、高级结构等的变化，从而导致蛋白质的活性、稳定性等物理和生化特征的改变[6-7]。蛋白质的AAR 修饰研究对疾病生物标志物的探寻、重大疾病发病机制的探索等均具有重要意义。

2 外消旋化修饰与疾病相关性

生物体内AAR 修饰速率较慢[8]。在含有代谢稳定的长寿蛋白质的各种人类和动物组织中，能够发现AAR 修饰呈年龄依赖性。对不同年龄层次人群的椎间盘弹性蛋白（intervertebral disc，IVD)中天冬氨酸（Asp）的AAR 修饰进行分析[9]，结果显示弹性蛋白中D-Asp 与L-Asp 比值随年龄增长呈升高趋势，并推测IVD 中Asp 的AAR 修饰可能干扰弹性蛋白、胶原蛋白和蛋白聚糖分子的三级结构和功能，引发椎间盘的组成和结构发生变化，从而导致疾病的发生[10]。人大脑神经纤维蛋白（Tau 蛋白）的相关研究发现，Tau 蛋白重复结构域中Asp265发生AAR 修饰[11]，人大脑中D-Asp 水平显著增加可能使维持髓鞘结构和白质正常功能的蛋白失效[12]，导致大脑功能障碍或阿尔茨海默病（AD）。其他如晶状体中的α-、β-晶体蛋白[13-14]也存在年龄依赖性的AAR 情况。

3 蛋白质整体外消旋化修饰的分析方法

蛋白质整体AAR 修饰水平一般通过水解后分析D-与L-氨基酸的比值来评价。通常提取分离目标蛋白后，采用酸水解法将蛋白质水解成游离氨基酸，然后分析各氨基酸D-型与L-型的比值，从而判断蛋白质中各氨基酸AAR 修饰水平。

常用的分析手段包括液相色谱质谱联用技术（LC-MS）、毛细管电泳色谱质谱联用技术（CE-MS）、二维液相色谱质谱联用技术（2D-LC-MS）及核磁共振（NMR）技术等。LC-MS 法通常使用手性衍生化试剂将酸水解后的D-/L-氨基酸衍生化，得到互为非对映异构体的衍生产物，在反相柱上分离后进行质谱检测。常用的手性衍生化试剂包括2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖异硫氰酸酯（GITC）[15-16]等，一些新型衍生化试剂如琥珀酰亚胺基(4S)-(3-[（苄氧基）羰基]-5-氧代-1，3- 唑烷-4-基)乙酸酯[(S)-COXA-Osu]等[17]因具有质谱兼容性好、生物基质影响小等优点而被用于AAR 修饰的分析。

CE-MS 法多数通过在电泳缓冲液中加入手性试剂从而实现D-/L-氨基酸的分离和AAR 修饰的测定，常用的手性选择剂包括环糊精等[18]。同时，有文献报道可使用异硫氰酸荧光素（FITC）结合毛细管电泳/激光诱导荧光技术（CE/LIF）来对神经肽的AAR 修饰进行检测[19]。

2D-LC-MS 法的优势在于可减小生物样本基质干扰，以叔丁基氨甲酰奎宁（tBuCQN）手性柱和奎尼丁（tBuCQD）手性柱为一维和二维的色谱柱，由于这2 种固定相具有相似的化学选择性和相反的手性结构，对手性组分呈现反向洗脱顺序，使其在一维和二维中的洗脱位置不同，而非手性组分在一维及二维色谱中洗脱位置不变，从而从目标对映体的色谱空间中去除，避免与潜在干扰重叠[20]。

NMR 法是通过对含有（R）-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸的样品溶液进行1H-NMR 分析，对结果中1 个或多个质子的光谱不等效性进行比较，有效地实现氨基酸AAR 修饰的鉴别[21]。

上述这些方法可用于蛋白质整体AAR 修饰水平的鉴定和测定，但一方面受到蛋白质水解、衍生化过程中L-氨基酸向D-氨基酸转化的干扰，另一方面仅能对蛋白质中各氨基酸整体的AAR 修饰情况进行鉴定，无法确定AAR 修饰位点，更难以实现蛋白质活性中心等特定位点的AAR 修饰的分析[22]。

4 特定位点外消旋化修饰的分析方法

特定位点AAR 修饰分析方法可确定AAR 修饰位点，通常用于蛋白质中活性中心或功能相关肽段中的AAR 修饰的定量检测。常用的分离分析手段包括特异性酶解LC-MS 法、免疫分析法。

蛋白质特异性酶解LC-MS 法是使用一些具有特异性识别位点的酶对蛋白质进行酶切，得到包含目标氨基酸的肽段，从而可对特定位点氨基酸AAR修饰进行定量测定。天冬氨酸N 端内切酶（Asp-N）仅识别L-α-Asp 残基的N 端，蛋白异天冬氨酰甲基转移酶（PIMT）只切割含有L-β-Asp 的肽段[23]，D-天冬氨酸内切酶（paenidase）[24]只特异性识别D-α-Asp 残基的N 端。现已成功联合应用这3 种特异性识别D-/L-Asp 的商品化酶来鉴别晶状体中Asp 的AAR 修饰情况[25]。但此方法由于酶的特异性，可能存在无法识别酶切位点，从而产生假阴性结果，如D-天冬氨酸内切酶无法特异性消化αBT10 肽段（αB-晶体蛋白中第93 至103 位的氨基酸序列），推测是由于D-天冬氨酸内切酶具有序列特异性[25]；此外，商品化酶的使用成本较高，不适用于大量样品的检测分析[26]。

酶联免疫吸附测定法（ELISA）根据其抗体的序列特异性可确定AAR 位点并进行定量测定。通过酶标记的抗原-抗体反应，通过吸光值检测可对D-与L-Asp 的比值进行检测，但免疫学测定法需要分析物预选，目前商品化试剂盒种类较少[27]。

上述方法的反应条件较温和，操作中不易产生额外的AAR 修饰，能对蛋白质活性中心或底物结合位点等功能相关位置的AAR 修饰情况进行检测，无需合成肽段，具有快速、低成本，以及工作量少等优点[25]，可用于探究AAR 修饰对蛋白质活性的影响。但这些方法大多以蛋白质特定位点或特定氨基酸为靶向，无法分析蛋白质其他位点上的AAR修饰情况。

5 非特定位点外消旋化修饰的分析方法

为了更全面地探究体内外AAR 修饰的规律，评价蛋白质功能、阐明疾病发病机制，亟需一些普适的非特定位点AAR 修饰的分析方法，目前可应用于非特定位点AAR 修饰测定的方法主要包括酶解LC-MS 法、氨肽酶（aminopeptidase，APM，EC 3.4.11.2）酶解法以及离子淌度质谱法等。

5.1 酶解LC-MS 法

酶解LC-MS 法应用于蛋白质中非特定位点氨基酸的AAR 修饰测定，测定时主要采用胰蛋白酶（trypsin）对目标蛋白质进行酶切，对酶解后的肽段进行选择性离子监测（SIM）模式扫描分析，分析比较保留时间有差异但具有相同相对分子质量的肽段的色谱峰，同时根据理论酶切位点合成对应的D-/L-标准肽段，通过保留时间来对酶解结果进一步确证，对其进行鉴定及定量分析。

Takata 等[28]从人体晶状体的水溶性部分中分离出βB2 晶体蛋白，用胰蛋白酶消化βB2 晶体蛋白后，使用Proteome Discover 1.0 软件中的SEQUEST 算法进行含Asp 肽的鉴定，然后进行SIM，与合成得到的理论酶切片段的保留时间相比较来确认βB2 晶体蛋白中Asp 的AAR 位点。结果显示，人体老化晶状体的βB2 晶体蛋白中存在多个AAR 位点，包括Asp4、Asp83、Asp92和Asp192，同时老年人晶状体βB2 晶体蛋白中D-与L-Asp 的含量比值随着年龄的增长而增长。

该方法采用的酶水解不会引起额外的AAR 修饰，能够准确定性及定量测定非特定位点AAR 修饰情况，方法不需要大量的样品蛋白质，无需复杂的提取纯化过程，能够从所有活组织和细胞中全面寻找受损或老化蛋白质中的AAR 修饰位点[29]。但该方法需要合成对应的酶解肽段进行质谱保留时间的确证，合成标准肽段较耗时[30]。

5.2 氨肽酶酶解法

APM 是一种膜结合外肽酶[31]，可以选择性地从寡肽、酰胺和芳基酰胺衍生物N-末端切除L-氨基酸，主要是碱性和中性氨基酸，其中特别是对亮氨酸、丙氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和蛋氨酸等氨基酸具有更高的选择性和更快的水解速度[32]，大多数L-氨基酸多肽可在1 ～ 2 h 内被消化。而在N-末端第2 个氨基酸位置上存在D-氨基酸或其他蛋白质翻译后修饰的多肽对APM 酶解具有抵抗性，这类含D-氨基酸多肽在数天的时间内都能保持稳定不被水解，其寿命是L-氨基酸多肽的10 倍以上。在研究中较常使用的APM包括亮氨酸APM、丙氨酸APM[33]等，APM 消化的敏感性与分子大小有关，当底物为小肽时，其酶解更快速且高效[34]。

Ewing 等[35]使用APM 酶解加利福尼亚海兔心脏神经肽，其L-氨基酸肽段被水解，含D-氨基酸的肽段被保留，课题组成功鉴别出心脏神经肽中具有AAR 修饰的肽段NdWFA，通过合成标准肽段对发生AAR 修饰的肽段进一步定量检测。该方法降低了中枢神经提取物的复杂性，不需要多肽对照品即可实现生物样本中蛋白质非特定位点AAR 修饰鉴定。Livnat 等[36]也使用APM 酶解法成功鉴别出加利福尼亚海兔神经肽中另一发生氨基酸AAR 修饰的肽段GdFFD，同时使用氘代盐酸对酶解后肽段进行酸水解、用Marfey 试剂标记以及液相色谱-质谱法来验证D-氨基酸的存在，确定发生AAR 修饰的氨基酸种类，并对D-氨基酸进行定量检测。对加利福尼亚海兔腹腔神经元中另一已知含D-氨基酸多肽的检测结果也验证了该方法的可行性，证明其对筛选潜在的含D-氨基酸多肽有效。

APM 酶解法能够成功鉴别蛋白质中非特定位点AAR 修饰，其特殊的酶解选择性可降低生物样本检测的复杂性，但也存在一定局限性，特定的N-末端残基会增加对APM 酶解的抵抗力，例如，在N-末端带有脯氨酸、谷氨酸的多肽可以抵抗APM 消化[35]，使这些多肽在较长一段时间内保持稳定，呈现假阳性结果。同时，当AAR 修饰发生在肽段中间附近，或发生在C-末端附近，则APM 在酶解过程可能会忽略这个位点[37]，从而导致假阴性结果，在这种情况下，可以对羧肽酶进行研究，看其是否具备与APM 类似的选择性酶切D-氨基酸的特性，为更全面研究AAR 修饰规律提供基础[36]。

5.3 离子淌度质谱法

离子淌度质谱（ion mobility mass spectrometry，IM-MS）是离子淌度光谱与质谱联用的一种新型质谱分析技术，其灵敏度高、检测限低并具有实时检测能力[38]。离子淌度质谱分离原理主要是基于离子的大小和形状的差异，离子受电场力作用向前运动，但不同离子在飘移管中与缓冲气体碰撞的截面不同，产生不同的阻力从而使其穿过漂移管所需的漂移时间存在差异[39]。较为常用的离子淌度质谱有漂移时间离子迁移质谱（DTIMS）、行波离子迁移质谱（TWIMS）及场不对称波形离子迁移质谱（FAIMS）[40]这3 种。目前所使用的IM-MS 具备基质辅助激光解吸电离离子源（MALDI）或电喷雾离子源（ESI）等离子源，或四级杆质谱和离子阱质谱等质量分析器串联使用，从而提高检测的分辨率和灵敏度[41]。

在对含D-/L-氨基酸的多肽进行IM-MS 分析时，由于构型不同，离子穿过漂移管时有先后顺序[42]，D-/L-肽段的b/y 系列各碎片离子的检出是IM-MS 法鉴定外消旋化修饰位点的前提。碰撞诱导解离（CID）技术系使母离子与高压高能惰性气体（如He、N2等）发生反复碰撞，使分子积聚能量，当达到一定能量阈值，化学键发生断裂从而产生产物离子，但受肽段浓度、链长等因素的影响，其能提供的肽链信息有限[43]，特别是肽段带有多电荷且肽链较长时序列组成较难分析，导致IM-MS 难以鉴定AAR 修饰位点。利用电子转移裂解（ETD）技术[44]，将电子转移至质子化的肽段，可得到更全面的系列碎片离子并增强碎片响应（S/N），便于后续IM-MS 测定，其裂解方式可以提供蛋白质翻译后修饰的重要序列信息，从而大幅度提高AAR 修饰检测的覆盖度和灵敏度，因此在蛋白质组学、复杂化合物以及AAR分析方面显示出特有的优势，逐渐在分析方面占据重要地位[45-46]。

Dwivedi 等[47]采用漂移时间离子迁移质谱法（DTIM-MS），以(S)-(+)-2-丁醇为漂移气体改进剂，不同离子在漂移室中经电场力作用，与漂移室中的中性气体发生碰撞，各离子因结构不同，受到的前进阻力也有差异，因此穿过漂移室的时间也各不相同，从而得以分离。该方法成功分离了包括丝氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸和色氨酸等在内的多种物质。Yu等[48]采用离子淌度迁移质谱法研究了一些常见手性氨基酸，成功分离了色氨酸、脯氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸及组氨酸，该方法对含芳香环、长链以及活性侧链的氨基酸有显著的手性分离能力，峰间分辨率高达1.826[49]。

Jeanne Dit Fouque 等[50]使用行波离子迁移质谱法（TWIM-MS），其分离室中配备多个环形电极，相邻电极上的电压方向相反，从而形成如波浪般的电场压力，不同离子在电场中的行进速度不同，通过改变行波电场的移动速度可以很好地分离皮啡肽1-4、啡肽Ⅰ、生长激素抑制素-14、γ-黑素细胞刺激素（γ-MSH）等D-氨基酸多肽。对于具有多电荷的大分子多肽，选择监测[M+2H]2+或[M+3H]3+离子能有更好的效果。我们已经证明了该方法可以检测到定量限小于0.25%的AAR 多肽，比文献报道的其他LC-MS/MS 方法更好。分解AAR 多肽的碎裂模式可以识别具有多电荷的大分子多肽并进一步降低检测限和定量限，由于自由基驱动的MS/MS 过程比碰撞诱导的解离提供更好的AAR 修饰识别，TWIM-ETD/ECD-MS 技术将推动生物体中AAR 修饰分析的发展。Jia 等[51]采用TWIM-MS 法准确测定了肽段中的D-氨基酸的AAR 位点，并将该方法应用于高血糖激素中D-苯丙氨酸的AAR 检测。

离子淌度质谱法可以检测常规质谱法不能区分的复杂化合物或外消旋体等，同时与色谱分离方法相比，所需分析时间短，且该方法的样品前处理步骤少，简单易行，提高了AAR 修饰鉴定的效率，具有其独特的优势[52]，但D-/L-氨基酸肽段的IM-MS结果差异较小，生物样品中的AAR 修饰检测容易出现假阳性、假阴性的情况[53]。

6 结语

随着科学技术不断发展，蛋白质中非特定位点氨基酸AAR 的研究已愈发多样化，如何提高生物样本非特定位点AAR 修饰检测的准确率，减少检测结果的假阳性及假阴性情况，同时提高定量分析的重现性，是非特定位点AAR 修饰研究亟待解决的问题。建立更多高效简便的非特定位点氨基酸AAR位点鉴别及定量检测的评价方法，有助于更全面地研究体内外AAR 修饰对蛋白质生理功能的影响，也对阐明蛋白质AAR 与重大疾病间的关系具有重要意义。