基因魔剪CRISPR/Cas：核酸精准检测的新宠和利器*

冯春凤，王云霞，蒲晓允，熊 瑜，刘 飞 综述，张立群△ 审校

(1.陆军军医大学第二附属医院检验科，重庆 400037；2.陆军军医大学第一附属医院检验科，重庆 400038)

规则成簇间隔短回文重复序列及其相关蛋白(CRISPR/Cas)系统是细菌和古细菌在进化过程中形成的一种适应性免疫应答系统，其机理是保护自身免受入侵病毒和质粒的影响[1]。CRISPR由多个高度保守的重复序列与噬菌体或质粒DNA存在同源性的间隔序列串联而成[2]。CRISPR区域中，位于第一个重复序列上游的是前导序列，负责CRISPR序列转录生成CRISPR RNA(crRNA)。CRISPR位点附近为CRISPR相关蛋白基因Cas，Cas基因编码的蛋白具有核酸内切酶活性，可切割外源性DNA，是CRISPR/Cas系统执行防御功能的重要组成部分。当病毒首次入侵时，细菌将病毒小片段DNA整合到自身CRISPR基因的间隔序列中。病毒再次入侵时，CRISPR转录生成crRNA。在crRNA的引导下，具有核酸内切酶活性的Cas蛋白对含原型间隔序列毗邻基(PAM)的靶标序列进行特异性识别和切割[3]。研究表明，Cas蛋白不仅可用于基因编辑，在核酸检测方面也具有非常重要的应用价值[1]。

现有的核酸检测方法大多数操作步骤复杂且依赖于昂贵的仪器设备。理想的核酸检测技术应具备便携、快速、低成本、灵敏度高及特异性强的特点。近期，科学家们将被誉为“基因魔剪”的CRISPR/Cas系统与其他技术尤其是核酸扩增技术相联合，开发了一系列基于CRISPR/Cas系统的核酸检测技术。这些技术可直接检测经过简单处理的临床样本，样本用量极少且无需贵重仪器设备，显示出极高的灵敏度和特异度，操作极其简便，已具有发展成为理想的核酸快速精准检测技术的潜力。

1 CRISPR/Cas9在核酸检测中的应用

1.1CRISPR/Cas9 Cas9是Ⅱ型CRISPR/Cas系统的标志性蛋白，在反式激活crRNA(tracrRNA)与成熟crRNA碱基互补配对形成的双链RNA(tracrRNA/crRNA)的引导下，特异切割靶双链DNA(dsDNA)。由于tracrRNA/crRNA的设计较复杂，KONERMANN等[4]随后将tracrRNA和crRNA整合到一条RNA链中，并称之为单向导RNA(sgRNA)，极大地简化了CRISPR/Cas9系统的操作步骤。Cas9介导的位点特异性DNA切割依赖于sgRNA对靶序列dsDNA上的PAM序列的特异识别，不同来源的Cas9识别的PAM序列存在差异。其中，应用最广泛的化脓性链球菌Cas9核酸内切酶切割靶标时依赖于含5′-NGG-3′的PAM序列。当存在与靶标单链DNA(ssDNA)或单链RNA(ssRNA)杂交并起到PAM作用的寡核苷酸时，sgRNA/Cas9也可以裂解ssDNA和ssRNA。

1.2基于Cas9核酸内切酶活性的核酸检测技术 针对不同的检测靶标可设计与之互补配对的sgRNA，从而使Cas9/sgRNA复合物可特异性切割各种不同靶序列。2016年，PARDEE等[5]最先将CRISPR/Cas技术用于核酸检测。他们将CRISPR/Cas技术与合成技术相结合，开发了一种快速、低成本检测寨卡病毒及区分其亚型的纸质传感器。寨卡病毒RNA经核酸依赖性扩增及逆转录产生的dsDNA作为sgRNA/Cas9复合物的底物，另外设计一个分子开关作为检测RNA的传感器，并将这种传感器转移到试纸条上冷冻干燥。随后将核酸依赖性扩增检测技术的反应产物滴加到试纸条上，通过观察试纸条的颜色是否发生改变，判断检测结果。应用该技术可检测不同的寨卡病毒亚种，并区分出感染后临床症状相似的登革热病毒。由于病原体存在进化漂移，因此分子诊断技术必须具备检测基因突变的能力。该研究证实，具有高达4-nt(11%)错配的变异菌株也能够完全激活分子传感器，表明该技术具有耐受自然界中预期遗传变异的能力。HUANG等[6]将CRISPR/Cas9技术引入等温指数扩增反应，开发了基于CRISPR/Cas9技术的指数扩增反应。他们将CRISPR/Cas9切割ssDNA产生的短片段作为等温指数扩增反应的引物，使该技术适用于长链DNA或RNA的检测，扩展了等温指数扩增反应的检测范围，避免了外来引物的非特异性扩增。该方法具有较强特异性和检测速度，检测限可达0.82阿摩尔，适用于DNA、RNA和甲基化DNA等多种核酸的检测，在生物分析和疾病诊断中具有巨大的应用潜力。

1.3基于dCas9特异结合靶序列的核酸检测技术 dCas9是经化学修饰的Cas9，虽然其失去核酸内切酶活性，但仍然具有特异结合靶DNA的能力。ZHANG等[7]利用成对CRISPR/dCas9开发了一种PC核酸报告系统，并与聚合酶链式反应(PCR)联合，用于检测结核分枝杆菌。他们将荧光素酶的N端和C端(NFluc和CFluc)分别标记一对dCas9，当sgRNA/NFluc-dCas9、sgRNA/CFluc-dCas9与同一靶标结合且两结合位点间距在(21±2)bp之间时，荧光素被氧化，发出荧光信号，从而检测出病原体。随后，QIU等[8]也开发了另一与之类似的核酸检测技术，即RCA-CRISPR-split-HRP(RCH)系统。microRNA以哑铃型探针为模板，经滚环扩增以后，形成大量茎环状靶标。两个dCas9分别被辣根过氧化物酶(HRP)片段(sHRP-C和sHRP-N)标记(sHR-C-dCas9和sHRP-N-dCas9)，然后与茎环状靶标特异性结合，导致裂解HRP重建，底物四甲基联苯胺从浅黄色变为蓝色，从而实现microRNA的检测。YANG等[9]，利用dCas9与靶标dsDNA特异性结合而不切割的特点，将其引入固态纳米孔传感技术。当sgRNA/dCas9复合物与靶标结合并穿过固态纳米孔时，大大减少了离子的通过，从而产生明显的电流阻断信号。HAJIAN等[10]将sgRNA/dCas9与场效应晶体管相结合，开发了一种无需标记的CRISPR芯片技术。他们将dCas9固定在场效应晶体管表面，并与sgRNA形成复合物，从而特异地结合靶标并产生相应的电化学信号，该芯片在不扩增靶标的情况下即可达1.7 fM的灵敏度，并且在15 min内就可读取检测结果。

2 CRISPR/Cas12a在核酸检测中的应用

Cas12a(又名Cpf1)属于V型CRISPR/Cas系统，在crRNA的引导下特异识别裂解富含T核苷酸PAM序列的dsDNA或ssDNA[11-12]。2018年，CHEN等[13]发现毛螺旋菌科细菌(Lb)ND2006 Cas12a(LbCas12a)在crRNA的引导下，特异切割靶ssDNA或dsDNA后，也可非特异性诱导其附近非靶ssDNA的断裂，具有与Cas13a相同的“附属切割”活性。随后他们将重组酶聚合酶扩增反应(RPA)与LbCas12a偶联，开发了DNA内切核酸酶靶向CRISPR反式报告基因(DETECTR)核酸检测技术。应用该技术成功检测出了人乳头瘤病毒16型和18型。DETECTR可在1 h内检测出靶标并且灵敏度可达阿摩尔级，其检测结果与PCR检测结果具有良好的一致性。LI等[14]将crRNA/Cas12a与PCR相结合，开发出灵敏度、高特异性强的HOLMES核酸检测系统，但该检测系统需经过两步反应。为了避免交叉污染，简化操作步骤，后来他们开发出一步式反应。LI等[15]选取一种耐热的Cas12b蛋白与环介导等温扩增(LAMP)技术相结合，从而实现一步式反应，他们将该技术命名为第2版HOLMES(HOLMES V2)。WANG等[16]将RPA扩增试剂和Cas12a酶放在物理上相互分开的同一试管中，在RPA反应15 min后，Cas12a才添加到反应系统中，从而实现一步法检测。

上述基于CRISPR/Cas12a的核酸检测技术均结合了各种核酸扩增技术。最近，研究者不断尝试将该技术与各种传感器相结合，试图开发灵敏度高、特异性强的生物传感技术。 SHAO等[17]将传统的两端分别标记荧光基团和猝灭基团的ssDNA荧光报道分子用磁珠-ssDNA-铂纳米(PtNP)复合物取代。当crRNA/Cas12a结合并切割靶标时，ssDNA也被非特异性地裂解，从而释放出PtNP。随后将该反应产物滴加到芯片上，通过PtNP催化过氧化氢产生的氧气量来计算靶标的水平。DAI等[18]将crRNA/Cas12a引入电化学传感器，该技术对HPV-16及细小病毒B19的检测灵敏度达皮摩尔级。此外，他们通过设计针对转化生长因子β1的适配体，从而实现了基于电化学和CRISPR/Cas技术的转化生长因子β1的检测。该技术的成功开发表明CRISPR/Cas技术不仅在检测核酸方面具有重要的应用价值，而且在蛋白检测方面也具有应用潜力。

3 CRISPR/Cas13a在核酸检测中的应用

Cas13a(以前称为C2c2)属于Ⅵ型CRISPR系统，对靶标的识别依赖于由A、U或C碱基组成的PFS序列(相当于PAM序列)[19]。在crRNA的引导下，Cas13a特异性切割靶标ssRNA后，表现出核糖核酸酶活性，可将靶标附近的非特异性ssRNA进行切割[20]。GOOTENBERG等[21-22]将高度特异性的crRNA/Cas13a与RPA等温扩增技术相结合，开发了一种特异性强、灵敏度高的酶报告解锁(SHERLOCK)核酸检测系统。该技术具有阿摩尔级的灵敏度和识别单个核苷酸错配的特异性，当与T7 RNA聚合酶转录偶联时，扩增的DNA可转录为RNA。因此，SHERLOCK在DNA和RNA的快速检测方面均具有重要的应用价值。为了简化操作、降低成本，随后他们又开发了基于试纸条的SHERLOCK核酸检测技术。通过16个患者样品的SHERLOCK和寨卡病毒逆转录PCR的检测结果比较发现，两种检测方法的灵敏度、特异度、一致性均达100%[23]。此外，该技术已成功用于鉴定细菌病原体、耐药基因筛查以及无细胞肿瘤DNA突变等的检测。

SHERLOCK系统虽可快速、灵敏地检测核酸分子，但仍然存在一些局限，例如缺乏定量，依赖荧光设备读取检测结果，一次只能检测一种核酸等。为了突破这些局限性，他们随后将SHERLOCK系统进行了改装，开发了更具有实用性的第2版SHERLOCK(SHERLOCK V2)核酸检测技术。GOOTENBERG等[22]发现，来自不同细菌的Cas13在附属切割时，对报告ssRNA中碱基的切割位点不同。他们在原版SHERLOCK中同时引入LwaCas13a，PsmCas13b，CcaCas13b和AsCas12a 4种核酸内切酶，设计针对4种不同靶标的crRNA并与相应的Cas蛋白组装，用发出不同颜色的荧光分子分别标记4种特异合成的报告ssDNA或ssRNA。当检测到靶标时，相应报告分子裂解，释放对应颜色的荧光信号，从而实现在同一反应中检测出4种不同的靶标。随后他们又发现，在较低的引物水平下，反应不会达到饱和。因此，可通过控制引物的水平而实现核酸定量检测，且检测物水平可低至阿摩尔级。为了扩大SHERLOCK系统的输出信号，他们又引入CRISPR Ⅲ型效应核酸酶Csm6，该核酸酶能被环状腺苷酸分子或末端含2′、3′-环腺苷酸的线性腺嘌呤同聚物激活[24-25]。研究发现，Cas13蛋白的附属切割恰好可以产生末端含2′、3′-环腺苷酸的裂解产物，通过Cas13与Csm6偶联，从而使输出信号进一步放大。另一方面，为了解决结果读取依赖于仪器设备的问题，他们用FAM-生物素标记报告基因开发了简便的检测试纸条。试纸条进样端包被捕获FAM的抗FAM抗体和金纳米颗粒缀合物，在试纸条第一反应区固定与生物素具有高亲和力的链霉素，第二反应区固定能捕获FAM-抗FAM抗体复合物的物质。如果报告基因被Cas13裂解，试纸条上可出现两条肉眼可见的条带，反之只在第一反应区出现条带。这种读取结果的方法类似于胶体金的检测原理，扩展了SHERLOCK V2在缺乏医疗设备的野外或现场病原检测中的应用。在此基础上，他们又开发了利用加热和化学还原法来溶解病毒颗粒及灭活核糖核酸酶的方法—HUDSON[23]，使SHERLOCK系统可直接检测临床样本，而无需DNA或RNA的提取和纯化。QIN等[26]将crRNA/Cas13a引入微流控技术，开发了自动化多路复用CRISPR微流控芯片，该检测体系所需样本量低至10 μL，检测时间短至5 min，不经过核酸扩增，检测灵敏度即可达20 pfu/mL，并可同步检测24个样本。

4 CRISPR/Cas14a在核酸检测中的应用

Cas14a是迄今为止发现的最小的RNA引导核酸内切酶，由400～700个氨基酸组成，比Cas9小两倍。与Cas12a和Cas13a相同，Cas14切割靶标ssDNA后，也具有非特异性附属切割活性，可用于单核苷酸突变分型(Cas14-DETECTR)[27]。与其他2类CRISPR效应子不同的是，Cas14a-tracrRNA-crRNA可识别切割任何与之具有20 nt核苷酸互补的靶ssDNA而不受PAM序列的限制。由于该蛋白对种子区中间部位的碱基突变非常敏感且不需要PAM序列的激活，因此该蛋白在基因组单碱基突变检测方面具有重要的应用价值。

5 CRISPR/Cas系统在核酸检测中面临的挑战

CRISPR/Cas技术在核酸检测方面已经取得了巨大成就，在核酸快速精准检测方面具有诸多优势：(1)通过加热等简单地处理包括血液、尿液、分泌物等临床样本，而不需要复杂的核酸提取；(2)反应所需的试剂耐受冷冻干燥，便于存储使用；(3)检测时间短，一般2 h内即可报告检测结果；(4)简单便携，不依赖于电力和昂贵的仪器；(5)结果读取方便，通过荧光检测或肉眼观察即可读取检测结果；(6)检测灵敏度高，特异性强，可用于单碱基突变检测；(7)检测范围广，可用于DNA、RNA、甲基化以及蛋白质等检测。但是，CRISPR/Cas技术在核酸检测方面仍存在许多障碍和局限，主要表现在以下几个方面：(1)sgRNA对靶位点的正确识别依赖于PAM序列且不同物种的CRISPR/Cas系统识别不同的PAM序列，虽然这种特性在某种程度上增加了该系统的特异性，但同时降低了靶标的选择范围，增加了相应sgRNA的设计难度。LI等[15]通过在HOLMES和HOLMES V2中使用含有PAM的引物将PAM序列引入PCR或LAMP的扩增产物中，使HOLMES和HOLMES V2能够以不依赖于PAM序列的方式检测核酸。(2)由于CRISPR/Cas技术的“脱靶”效应，可能导致假阴性。笔者推测，在基因库中筛选最优的靶标、寻找其他来源的Cas蛋白或CRISPR系统的突变体可能有助于解决“脱靶”问题。随着未来“脱靶”效应的解决，CRISPR/Cas技术在核酸检测中的准确性必将得到更大程度地提高。(3)由于自然界中存在大量核糖核酸酶且十分稳定，sgRNA、报告基因RNA等容易被污染而遭到破坏，导致错误的检测结果。(4)CRISPR/Cas技术使用针对已知碱基序列靶标的特异性探针来检测DNA或RNA，因此检测新出现的病原体或快速突变的RNA病毒时可能面临巨大的挑战。尽管存在这些问题，但CRISPR/Cas技术依然为核酸检测提供了强大的新工具和新技术。因此，进一步研究以解决CRISPR/Cas技术的局限性将为重大疾病的病原核酸快速精准检测铺平道路。

6 总结及展望

目前，核酸检测一般包括病原体的分离、核酸提取与扩增、检测结果分析等，耗时长且对医疗设备和操作人员的专业水平要求很高。便携、快速、低成本、灵敏度高及特异性强的核酸检测技术对生物学研究和临床诊断具有非常重要的意义。本文概述的几种基于CRISPR/Cas技术的核酸检测证明了该系统不仅具有强大的基因定点编辑能力，而且在分子精准诊断领域具有重要的应用价值。SHERLOCK V2、CRISPR微流控芯片等技术的开发表明CRISPR/Cas系统具有同时检测多个靶标的潜力。虽然单独的CRISPR/Cas系统对核酸检测灵敏度的提升有限，大多数需要跟核酸扩增技术相结合，但研究者发现将CRISPR/Cas系统与生物传感器相结合，同样具有极高的灵敏度，并可实现核酸的定量检测。该系统与其他核酸检测技术的结合，预示该检测技术有望不依赖于昂贵设备和专业技术，在现场快速检测领域具有巨大的应用前景。随着不断发现新的Cas蛋白，CRISPR/Cas技术有望实现在分子水平上精确可靠的诊断病原体或鉴别突变癌基因。现阶段，实验室CRISPR/Cas核酸检测研究与复杂临床检测应用环境中的有效性仍有待观察。为了确保检测结果可靠准确，基于CRISPR/Cas的核酸检测技术在进入临床应用前还需经过更深入的科学研究。随着众多科学家的不断探索和技术上的不断创新，被誉为“基因魔剪”的CRISPR/Cas技术必将成为核酸精准检测领域的新宠和利器。