肠杆菌科细菌替加环素耐药机制的研究进展

朱瑞奇，吴韩，曾杨梅，吴俊伟

（1.西南大学动物科学学院，重庆荣昌402460；2.重庆布尔动物药业有限公司）

肠杆菌科细菌属于革兰阴性菌，常寄生于人和动物体内，可在土壤、水和腐烂物中检测出，能引起多种感染，如肺炎、肝脓肿、尿路感染、菌血症、败血症等，是引起感染的重要病原体之一。近年来，由于抗生素的普遍使用，引发了严重的耐药危机，尤其是产碳青霉烯酶菌的出现，该类型的肠杆菌几乎对所有的抗生素耐药，严重威胁了人类的健康[1]。

替加环素是1999年Phaik-Eng Sum[2]首次报道具有强大抗菌活性一种新型合成甘氨酰环素类抗菌药物，全称为9- 叔丁基甘氨酰氨基米诺环素，是继多西环素、米诺环素、美他环素后开发的新一代四环素类衍生抗生素，主要用于复杂的皮肤结构感染，腹腔内感染及细菌性肺炎患者的治疗。自美国批准上市用于临床后，替加环素因抗菌谱广、抗菌活性强、耐药率低等优点而逐渐成为医学临床抗菌药物中治疗各类细菌感染效果最好的，也是最后一道防线药物[3]。然而，随着临床抗感染治疗中替加环素的不断使用，有研究者已经分离出替加环素临床耐药菌[4]。细菌对替加环素的耐药机制十分复杂，主要包括外排泵机制、细胞膜孔通道蛋白变异、药物结合位点改变及药物酶降解。目前国内外对替加环素耐药性机制研究主要集中在细菌的主动外排泵机制以及新发现的物质替加环素降解酶Tet(X)上。现就肠杆菌科对替加环素耐药机制进行综述，以减少细菌耐药性产生和延长替加环素使用年限提供理论依据。

1 外排泵

1.1 AcrAB-TolC 外排泵

AcrAB-TolC 外排泵是肠杆菌科细菌中RND 家族是目前研究比较透彻的一类外排泵，这类外排泵既能外排对菌体有害的物质，还能在某些条件下将致病菌的毒性因子排出。此类外排泵以不对称三聚体的结构出现，包括外膜通道蛋白TolC，内膜转运体AcrAB、周质蛋白AcrA 三部分。其中外膜和周质蛋白主要是结合位点，而跨膜结构作为质子的通道，保证能量来源[5]。由正调控因子和负调控因子共同调节[6]，正调控因子主要包括MarA 蛋白、Rob 蛋白，SoxS 蛋白可向上调节AcrAB 基因表达水平从而导致耐药，负调控蛋白主要包括AcrR 蛋白，MarR蛋白主要通过拮抗RamA 蛋白和MarA 蛋白从而抑制AcrAB 基因表达[7]。目前研究发现替加环素耐药与AcrAB-TolC 外排泵有关，Keeey,D.等[8]对临床三期分离的对替加环素耐药的大肠杆菌通过插入序列基因检测等技术发现当MarR 基因突变使marA表达不受调控，引起AcrAB 过表达，以此增加临床菌株对替加环素的耐药性。Xu H 等[9]在血液样本中分离出对替加环素耐药的菌株，通过基因测序发现ramR 基因突变，导致AcrAB-TolC 过表达，从而表现出对替加环素耐药。Mariu 等[10]通过让大肠杆菌生长在酸性含有胆汁盐的条件中，发现存活下来的细菌有一部分lon 基因发生突变，其中lon 蛋白酶参与了大肠杆菌中marA 的降解，当其功能损失时导致Mar 浓度增加，这会使AcrAB 外排泵过表达，增加菌株对替加环素耐药，使大肠杆菌表现出更强的替加环素抗性。

He F 等[11]对收集的肺炎克雷伯菌进行药敏实验分析，最终确定的耐替加环素肺炎克雷伯菌株，通过基因测序等技术分析发现外排泵AcrAB-TolC表达量及其调控基因与MIC 成正比，且当使用外排泵抑制剂的时候，MIC 的表达量明显减少。Rajendran R 等[12]采用棋盘法对临床分离的肺炎克雷伯菌进行研究分析，发现加入外排泵抑制剂时菌株能明显恢复对替加环素的敏感性。何方[13]通过基因敲除、体外诱导等技术发现大肠埃希菌25922-TGC8 中对替加环素耐药是mla 系统外排泵AcrAB-TolC 和核糖体蛋白变异3 种机制共同作用的结果，最终使菌株对替加环素的MIC 从0.125mg/L 上升到8mg/L。因为mla 系统，外排泵AcrAB 和核糖体蛋白均由细菌染色体编码，当细菌在替加环素药物选择作用下，外排泵基因易发生突变，进而导致替加环素耐药的发生。且通过敲除acrAB 基因发现，细菌基因缺失株明显增加对替加环素的敏感性。后有学者发现除了大肠杆菌、肺炎克雷伯菌外，其余肠杆菌属细菌对替加环素均具有耐药性[14]。

1.2 KpgABC 外排泵

KpgABC 外排泵是RND 家族新发现的一种外排泵。Nielse L E 等[15]在耐替加环素的肺炎克雷伯菌的外排泵操纵子上游发现了1 个IS5 插入序列并命名为KpgABC 在耐药菌株中过量表达。细菌一般在恶劣的环境下容易发生突变，突变的类型一般包括碱基的置换、插入和缺失以及转位因子的变异。而插入序列突变一般发生在细菌操纵子的上游与细菌的运动能力和生物膜形成的能力有关，同时细菌的生长速率会降低。其中IS5 作为家族成员最多的插入序列对耐药基因的转移发挥着至关重要的作用[16]。Juan C 等[17]在肺炎克雷伯菌菌血症患者中发现，有一例菌血症患者由于KpgA 基因过度表达导致肺炎克雷伯菌对替加环素耐药。且通过克隆转化等实验技术证明，即使没有其他外排泵的调节，单独的KpgABC 外排系统即可导致肺炎克雷伯菌外排替加环素,虽未达到EUCAST 判断标准，但明显该菌株对替加环素MIC 增加，与AcrAB-TolC 外排泵相比可能KpgABC 外排由于亲和力较弱，或者由于替加环素外排速度较低，导致细菌胞体内药物增加。

1.3 OqxAB 外排泵

OqxAB 外排泵属于RND 家族，在2004年猪源大肠杆菌中首次发现的一种新型质粒编码的外排泵，对于不同抗生素的抗性该基因位于不同类型的质粒上，可介导呋喃妥因，氯霉素，氟喹诺酮类包括替加环素等多种药物耐药的外排系统[18]。与AcrAB-TolC外排泵结构不同其主要由两大结构构成即膜融合蛋白OqxA 和内膜转运蛋白OqxB 组成，质粒传播的OqxAB 一般来源于肺炎克雷伯菌的染色体[19]。Liu B等[20]证明由质粒编码的OqxAB 基因较容易在动物，动物源性食品和人类之间水平传播。

Chen 等[21]发现携带OqxAB 质粒的菌株对替加环素耐药，并通过细菌摄入学实验测定该菌体内替加环素的积累量，直观表明OqxAB 外排泵的对替加环素耐药的活性，且当使用外排泵抑制剂及质粒转移能明显恢复菌株对替加环素的敏感性。Wang J[22]发现oqxR 和RamR 基因突变都可以激活OqxAB 外排泵，造成细菌耐药，但RamR 突变时既可以激活oqxAB 也可以激活AcrAB-TolC 外排泵。Juan,C 等[17]通过对患肺炎克雷伯菌菌血症调查发现，在治疗前接触过喹诺酮类药物会增加细菌对替加环素耐药的可能性，对替加环素耐药的患者中，通过基因的表达量分析得知大部分AcrAB 或OqxAB 外排泵过度表达所致，其中一例患者是由KpgABC 过度表达所致，当喹诺酮类药物使用时，会增加RamA 基因突变的可能性，从而上调OqxAB 外排泵基因，最终导致肺炎克雷伯菌对替加环素耐药。Veleba 等[14]在对替加环素耐药的阴沟杆菌中发现，ramA 和rarA基因的表达量增加，导致OqxAB 和AcrAB 外排泵过表达，使菌株降低对替加环素的敏感性。随后Hang Liu 等[23]在也替加环素耐药菌株中发现AcrAB和OqxAB 过表达，替加环素耐药可能与这两种基因都有关，是否是协同作用，需更进一步研究。

1.4 AcrEF 外排泵

在大肠杆菌的细胞膜上发现的一种新的外排泵-AcrEF 外排泵[23]，在大肠杆菌中RND 家族的外排泵都需要共同的外膜通道TolC，发挥其外排泵的功能。研究发现，AcrE 与AcrF 可以和TolC 结合形成类似于AcrAB-TolC 的三聚体外排泵。Zhang 等[25]在研究中发现，当AcrAB-TolC 外排泵失活后，AcrEF 外排泵的过表达可补充其功能，继续维持细菌的耐药性，但该泵在正常情况下并不发挥作用，该基因单独缺失对细菌的耐药性没有影响，提示在细菌中体内可能作为替代泵存在。研究还发现它与AcrAB-TolC 外排泵有高度的同源性并能外排相同的的物质，其中也包括了替加环素[26]。

1.5 Tet 突变体

Tet 属于MFS 家族外排泵，主要与细菌对四环素耐药性有关，然而最近的研究发现，Tet 外排泵突变可介导细菌对替加环素产生耐药。正常情况下Tet 外排泵主要位于在细菌细胞内膜的磷脂双层结构上，但由于外排泵的跨膜结构发生基因突变，导致替加环素MIC 值显著增高。Marius 等[27]通过对Tet 外排泵突变的菌株进行了替加环素最小抑菌浓度实验及基因测序后发现，Tet(A)和Tet(M)外排泵、核糖蛋白体Tet(K)及质粒编码的修饰酶Tet(X)四种基因突变均导致细菌对替加环素的MIC 增加，相比较而言Tet(A)在四环素抗性基因中对替加环素的耐药更占优势。Chiu 等[28]在替加环素耐药菌中，通过PCR 和基因测序技术发现菌株存在ramR，acrR，oqxR，Tet(A)，Tet(K)，Tet(M)及rpsJ 基因突变，其中大部分以Tet(A)突变为主，随后将该基因导入到ramR基因突变株中发现，发现两者具有协同作用。

2 结合位点突变

替加环素作用机制是通过可逆地结合于细菌30S 核糖体16S rRNA，阻断tRNA 进入A 位点，终止氨基酸进入肽链，抑制翻译过程，阻止蛋白合成，最终细菌繁殖受到抑制。由rpsJ 基因编码的S10 蛋白是30S 核糖体的组成部分，位于替加环素与结合位点的附近。研究发现当rspJ 基因突变时会使替加环素结合位点的S10 蛋白缺失，导致细菌与药物的结合位点发生改变，从而会使细菌产生耐药[29]。Fang L 等[30]对7 株替加环素耐药的肺炎克雷伯菌进行基因测序分析，发现一共有ramR，lon 及rpsJ 三种类型的突变，其中rpsJ 基因突变占耐药菌的14.2%。随后相继报道指出粪肠球菌，金黄色葡萄球菌对替加环素产生耐药均与rpsJ 基因突变有关[31]。Li 等[32]发现经替加环素治疗后患者更易出现rpsJ基因突变导致替加环素耐药。由于替加环素核糖体结合位点附近的S10 核糖蛋白发生突变，导致细菌对替加环素耐药，相比较于非特异性的依赖于细菌种类的主动外排泵耐药机制，rpsJ 基因缺失突变不依赖于细菌种类，具有高度特异性耐药，是多种细菌对替加环素耐药的靶点[33]。He 等[34]对肺炎支原体的患者连续进行替加环素治疗后，分离出耐药的肺炎克雷伯菌，并对其进行基因测序生物学技术分析，发现rpsJ 基因突变，表明rpsJ 突变在治疗的过程中可对替加环素产生耐药性。

3 细菌细胞膜变异

细菌细胞膜由糖脂，磷脂和蛋白质构成。plsC是催化合成磷脂的重要酶之一，同时也是一种跨膜蛋白，参与细胞渗透性功能[35]。PlsC 基因突变可导致细菌细胞膜通透性改变，降低细菌对替加环素的敏感性[36]。细菌膜上存在的膜孔蛋白是影响物质和抗生素进入细菌的主要途径，当细菌处于恶劣环境下时，膜孔蛋白基因发生突变，导致膜孔蛋白结构发生改变或者膜孔蛋白表达数量减少，改变细胞的通透性，从而导致细菌耐药。但是在大多数情况下，耐药菌株并不是单一的膜孔蛋白变异，一般与其他耐药机制共同存在。

4 修饰酶的降解

Tet(x)是一种质粒产生的四羟酮醇依赖的单氧化酶，在有氧和NADPH 条件下对四环素进行化学修饰，可促使临床应用的四环素包括替加环素失活，最先是在拟杆菌转座子Tn4351 和Tn4400 中分离纯化的四环素降解酶。Volkers 等[37]通过X 光衍射射线晶体学技术，表明替加环素是tet(x)的底物。随后，Bartha 等[38]在临床菌株中发现tet(x)及其同源基因tet(x1)，tet(x)和tet(x1)的流行率与替加环素敏感性有关，这些基因与质粒及转座子关系密切。Walkiewicz,K 等[39]利用X 射线技术也同样证明了tet(x2)作为四环素降解酶的作用。

He T 等[41]在动物源性的肠杆菌科细菌中分离出对替加环素耐药的抗性基因tet(x3)和tet(x4)。体内模型实验表明替加环素被这两种酶降解造成药物失活。随后Sun 等[41]在分离对替加环素耐药的大肠杆菌中，发现在质粒上存在替加环素抗性基因tet(x4)，全长1158 bp，编码385 个氨基酸蛋白，氨基酸含量为94.5%。该菌株能够降解所有四环素，包括替加环素。且进一步研究发现，临床菌株中IncQ1 质粒所携带的tet(x4)基因能够迅速高效的转移到各种临床耐药菌株和实验室保存菌株中。随后在养殖场附近的环境中以及动物的肠道中也发现了该基因，这也证实了质粒所携带的基因替加环素耐药基因tet(x4)可迅速传播[42]。

5 结语

致病性微生物耐药已经引起全世界的关注，主动外排泵转运系统，是引起的替加环素中低耐药为肠杆菌科的主要的耐药机制，后期应着重研究抑制外排泵抑制剂方向。另外一项新研究发现在动物及养殖环境中发现可以导致最后一道防线药物替加环素失活的质粒介导的降解酶tet(x4)，并具有高效转移性。虽然替加环素并未批准用于食品生产动物，但是在临床实践中如果持续使用四环素类的药物，tet(x4)基因也进入致病性病原微生物。因此应深入研究替加环素的耐药机制，改进用药方案，避免滥用抗生素，减少长期用药，尽可能采取交叉用药，穿梭用药或联合用药，延长替加环素使用年限。