沙葱黄酮对乌鳢血淋巴细胞活性、抗氧化能力及基因相对表达量的影响

■祝新茗 赵 静 夏长革 李沐阳 刘洪健 王桂芹*

(1.吉林农业大学动物科学技术学院动物生产与质量安全教育部重点实验室，吉林长春130118；2.吉林农业大学动物科学技术学院现代农业技术教育部国际合作联合实验室，吉林长春130118；3.吉林省长春市新立城水库管理局，吉林长春130119；4.吉林省水产技术推广总站，吉林长春130012）

乌鳢(Channa argus)是我国重要的淡水经济鱼类[1]。在集约化养殖环境下，乌鳢对各种病原体的易感性增加[2]，导致流行鱼病多发，造成了巨大的经济损失。为使死亡率降低，抗生素及免疫增强剂已用于预防或治疗养殖鱼类疾病[3]。然而，使用抗生素作为预防措施，除了会影响鱼类产品的安全性外，还会造成环境污染且会诱导产生耐药菌群[4]。免疫增强剂可以增强鱼类的疾病抵抗能力，促进鱼类固有免疫功能，增强鱼类适应性免疫能力[5]。因此，开发绿色经济的免疫增强剂，对水产养殖业持续健康发展具有重要意义。目前广泛应用的免疫增强剂包括益生菌[6]、维生素E[7]、大黄素[8]、壳聚糖[9]、虾青素[10]、多糖[11]和黄酮[12]等，在这些免疫增强剂中，植物提取物具有来源广泛、生物可降解、无耐药性、性价比高、环境友好等诸多优点[11]。

沙葱（Allium mongolicum Regel），百合科（Lilia⁃ceae Juss），葱属（Alliaceae）[13]。生长于高海拔沙漠地区和荒漠草原，风味独特，营养价值高，富含脂肪、蛋白质、矿物质、多糖、黄酮等多种营养成分[14]。作为一种野生蔬菜，沙葱及其提取物在促生长[14]、抗氧化[13]以及抗炎[15]等方面具有一定作用。黄酮类化合物是天然药物中重要的活性成分，在机体抗氧化、抗炎、抗病毒、抗癌等方面效果较为显著。目前许多植物黄酮已被用作免疫增强剂来提高机体抗氧化、抗炎能力，促进机体免疫应答，其中大豆异黄酮、淫羊藿黄酮、芒果叶黄酮、山核桃叶黄酮、枣叶黄酮等在水产动物上已有研究。研究表明，大豆异黄酮可以加快鱼类生长，提高免疫、抗氧化及抗病能力[16]。枣叶黄酮在斑马鱼体内有良好的抗氧化能力，且对其体内自由基具有良好的清除作用[17]。山核桃叶黄酮可以抑制斑马鱼体内凋亡基因的异常表达，降低活性氧（ROS）水平[18]。沙葱黄酮可以提高绵羊外周血淋巴细胞增殖率[15]，加速肉羊生长，促进其生长相关激素分泌[14]。

淋巴细胞（Lymphocyte）是机体淋巴器官产生的白细胞，参与机体特异性免疫反应，在机体免疫应答中起主要作用。而鱼类淋巴细胞是数量最多的一类白细胞，是鱼类免疫学研究的重要内容[19]。本研究旨在研究沙葱黄酮对乌鳢血淋巴细胞活性、抗氧化能力及炎症相关基因相对表达量的影响。

1 材料与方法

1.1 沙葱黄酮的制备

本试验采用超声提取法提取所需沙葱黄酮[14]，提取时间为15 min，温度40 ℃，所用乙醇浓度为75%，料液比1∶30。预计黄酮产量为12.85 mg/g 沙葱粉。使用二甲基亚砜（DMSO）作为溶剂，将沙葱黄酮配制为不同浓度的储存液，使用前用RPMI-1640培养液进行稀释。

1.2 试验鱼的饲养

试验所用乌鳢[（体质量（50±0.12）g/尾]购自辽宁刘二堡渔场，暂养于室内200 L水族箱中，驯化15 d，试验温度(26±2) ℃；pH值(7.1±0.1)；氨氮含量＜0.02 mg/l；亚硝酸盐含量＜0.05 mg/l，溶解氧＞5.0 mg/l，每日饱食投喂两次（8:00、16:00），每2 d更换半箱水。取样前停食24 h，使用MS-222（200 mg/l）进行麻醉，随机抽取5尾鱼，通过尾静脉穿刺取血，而后立即转移到无菌封顶预冷（4 ℃）抗凝管（氯化钠415 mmol/l、柠檬酸钠30 mmol/l、葡萄糖100 mmol/l、柠檬酸26 mmol/l、乙二胺四乙酸30 mmol/l，pH值4.6）中。

1.3 乌鳢血淋巴细胞的分离培养

乌鳢血淋巴细胞的分离参照谢昆等[20]的方法。将抽取的血液与磷酸缓冲盐溶液（PBS）以1∶2 比例混合稀释，将稀释后的血液平铺在淋巴细胞分离剂（北京索莱宝科技有限公司）表面，600×g离心20 min，小心吸取淋巴细胞层，加入等量的RPMI-1640 液，600×g离心20 min；弃掉上清液，以上述方法离心2次，弃上清液，获得细胞沉淀，通过血细胞计数器测定细胞数。将细胞放入含有20%胎牛血清（Gibco）和1%青霉素（北京索莱宝科技有限公司）的RPMI-1640 培养基中，培养前测定培养基中活细胞数量（台盼蓝染色法），调整至活细胞密度为1×106个/ml。

在细胞悬液中加1%的沙葱黄酮稀释液，调整沙葱黄酮浓度分别为0（对照）、25、50、100、200 μg/ml，将调整好的细胞悬液加入96 孔板中，每孔加入3 ml细胞悬液，每组5个重复。置于27 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h 后198×g 离心5 min。收集细胞液氮速冻后在-80 ℃下储存以测量抗氧化参数及相对基因表达。

1.4 乌鳢血淋巴细胞活性测定

采用MTT 法对乌鳢血淋巴细胞活性进行测定，对照组和添加组每孔分别抽取100 μl细胞液转入96孔U 型细胞培养板中，每孔加入10 μg/l Con A 100 μl，在27 ℃、5% CO2条件下培养24 h，培养至20 h 时，每孔加入5 mg/ml 噻唑蓝（MTT）20 μl，再放入培养箱中孵育4 h，培养结束后600×g离心10 min，弃上清液，每孔加入100 μl 二甲基亚砜，震荡10 min，570 nm 处测定各孔吸光度值。

1.5 抗氧化指标测定

总超氧化物歧化酶（T-SOD）、过氧化氢酶（CAT）、总抗氧化能力（T-AOC）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、丙二醛（MDA）、一氧化氮（NO）等抗氧化指标的测定严格按照南京建成生物工程研究所提供试剂盒说明进行操作。

1.6 荧光定量PCR测定

收集每组培养基中悬浮细胞，采用TRIzol试剂盒法（大连Takara 公司）提取总RNA，使用NanoDrop 2000 分光光度法（Thermo scientific，USA）分析RNA浓度及质量，按照TRIzol 逆转录试剂盒法（大连Ta⁃kara 公司）法将RNA 逆转录为cDNA。以β-actin 为内参基因，使用Takara Premix Ex TaqTM П荧光定量试剂盒进行测定，引物序列见表1。PCR 反应体系 包 括SYBR qPCR Mix（10 μl），上游和下游引物（10 mmol/l，1 μl），cDNA（1 μl），ddH2O（7 μl）。PCR 反应条件为预变性（95 ℃、30 s）；40 个循环（95 ℃、5 s；60 ℃、30 s）。

表1 引物序列

1.7 统计分析

试验所得Ct 值采用2−ΔΔCt法计算各基因的相对表达量。试验结果以“平均值±标准差”表示，采用SPSS 20.0 软件进行单因素方差分析，采用Tukey 多重比较分析组间差异显著性，若P＜0.05 则表示差异显著。

2 结果

2.1 沙葱黄酮对乌鳢血淋巴细胞活性的影响(见表2)

表2 沙葱黄酮对乌鳢血淋巴细胞活性的影响

如表2 所示，与对照组相比，随着沙葱黄酮浓度的增加，乌鳢血淋巴细胞活性呈先上升后下降的趋势。培养24 h后，各添加组血淋巴细胞活性均显著高于对照组（P＜0.05），其中100 μg/ml 处理组血淋巴细胞活性最高。

2.2 沙葱黄酮对乌鳢血淋巴细胞抗氧化能力的影响(见表3)

由表3 可知，随着沙葱黄酮剂量的增加，乌鳢血淋巴细胞T-AOC、NO、CAT、T-SOD及GSH-Px水平都呈现先上升后下降的趋势，MDA 含量呈现与之相反的趋势。50、100、200 μg/ml 添加组T-AOC、NO 水平显著高于对照组（P＜0.05），其余添加组与对照组无显著差异（P＞0.05）；100、200 μg/ml 添加组CAT 水平显著高于对照组（P＜0.05），其余添加组CAT水平与对照组无显著差异（P＞0.05）；所有添加组T-SOD、GSH-Px水平均显著高于对照组（P＜0.05）；100 μg/ml 添加组MDA 含量显著低于对照组（P＜0.05），其余添加组MDA水平低于对照组，但差异不显著（P＞0.05）。

表3 沙葱黄酮对乌鳢血淋巴细胞抗氧化指标的影响

2.3 沙葱黄酮对乌鳢血淋巴细胞基因相对表达量的影响(见表4)

如表4 可知，沙葱黄酮促进乌鳢血淋巴细胞HSP70、HSP90、IκBα、GR 基因的表达，抑制IL-1、TNF-α、IL-8、NF-κB p65 基因的表达。随着沙葱黄酮浓度的升高，HSP70、HSP90、IκBα、GR 相对表达量呈现先上升后下降的趋势，IL-1、IL-8、TNFα、NF-κB p65 的相对表达量则呈现先下降后上升的趋势。100 μg/ml 添加组IL-1、TNF-α相对表达量显著低于对照组（P＜0.05）；50、100、200 μg/ml 添加组NF-κB p65 相对表达量显著低于对照组（P＜0.05）；所有添加组IL-8 相对表达量均显著低于对照组（P＜0.05）。50、100、200 μg/ml 添加组GR 相对表达量显著高于对照组（P＜0.05）；100 μg/ml 添加组HSP70、HSP90、IκBα相对表达量显著高于对照组（P＜0.05）。

表4 沙葱黄酮对乌鳢血淋巴细胞基因相对表达量的影响

3 讨论

3.1 沙葱黄酮对乌鳢血淋巴细胞活性的影响

淋巴细胞是一种重要的白细胞，其细胞活性的高低可以在一定程度上反映机体的免疫水平。研究表明香菇多糖、灵芝多糖、枸杞多糖可有效提高黄颡鱼免疫细胞活性[21-23]；金荞麦根提取物可提高鸡脾淋巴细胞活性[24]；浒苔多糖能使小鼠淋巴细胞活性提高[25]；苜蓿多糖可促进小鼠淋巴细胞增殖[26]；沙葱黄酮能够促进肉羊外周血淋巴细胞增殖[15]等。与上述研究结果相似，本试验中100 μg/ml 沙葱黄酮添加组乌鳢血淋巴细胞活性最强，其余各组均显著高于对照组。

3.2 沙葱黄酮对乌鳢血淋巴细胞抗氧化能力的影响

抗氧化是抗氧化自由基的简称，机体受到外界刺激，体内会产生大量的自由基，过量的自由基会使细胞代谢紊乱，从而威胁养殖动物的健康。T-SOD、CAT、T-AOC、GSH-Px 是抗氧化系统中的最主要的酶，能够有效清除自由基；NO是由一氧化氮合酶催化精氨酸产生的气体信号分子，具有广谱杀菌性，一定程度的NO 可以反映机体固有免疫情况。MDA 是体内脂质过氧化物，过量产生会破坏细胞膜完整性被破坏、使细胞发生突变、对抗氧化防御系统造成损伤。有报道称，黄芪多糖可以提高杂交鳢抗氧化能力[27]；大豆异黄酮可以使大鼠体内抗氧化能力得到提高[28]；芦苇黄酮类提取物可以增强大鼠血清中GSH-Px、SOD活性，降低MDA含量[29]；沙葱黄酮可以降低山羊红细胞中MDA含量，提高T-SOD、CAT、GSH-Px水平[30]，也可以使小鼠血清和肝脏中抗氧化酶类的含量和活性升高，MDA 含量下降[31]。本试验结果表示，在一定剂量范围内，沙葱黄酮可以提高乌鳢血淋巴细胞中T-AOC、T-SOD、CAT、GSH-Px 以及NO 的水平，抑制MDA的生成，提高细胞抗氧化活性，这与以上报道所得结论一致。

3.3 沙葱黄酮对乌鳢血淋巴细胞基因相对表达量的影响

NF-κB是主要的促炎转录因子，它可被炎性细胞因子、氧化应激物、病毒和细菌产物等多种细胞外信号激活[32]。IL-1、IL-8 和TNF-α是有效的促炎因子，通过调节其他细胞因子的表达进而诱导炎症反应。GR 是核激素受体转录因子[33]。GR 可与NF-κB 信号通路相互作用共同影响炎症基因的表达水平[34]。热休克蛋白（HSP）是一类伴侣蛋白，包括HSP70 和HSP90，在GR 蛋白复合物形成过程中起重要作用[35]。研究表明，可可黄酮会下调NF-κB信号通路中炎症因子的表达[36]；韩国蓟马齿黄酮具有良好的抗炎作用[37]；中草药提取物可以上调团头鲂体内HSP70 的表达水平[38]。蒲黄总黄酮能使Ⅱ型糖尿病大鼠血浆IL-6 水平降低[39]。穗花杉双黄酮可减少急性肝损伤大鼠体内炎症细胞因子的释放[40]。染料木黄酮可抑制脂肪细胞NF-κB 通路的激活[41]。蓝莓叶总黄酮通过影响炎症相关因子表达，从而减轻炎症反应[42]。Chen等[43]研究发现，饲料中添加谷氨酰胺可以显著提高鲤鱼幼鱼GR 表达及HSP70 水平。本试验结果表明，不同浓度沙葱黄酮可提高乌鳢血淋巴细胞HSP70、HSP90、GR、IκBα基因的表达，抑制IL-1、IL-8、TNF-α、NFκB p65 基因的表达，这与上述研究结果基本一致，这证明沙葱黄酮可以调节机体免疫应答以及免疫相关基因的表达。

4 结论

综上所述，100～200 μg/ml 沙葱黄酮在一定程度上能够有效提高乌鳢血淋巴细胞活性、抗氧化能力、调节机体免疫应答以及免疫相关基因的表达。